A near-complete assembly of an Arabidopsis thaliana genome

拟南芥基因组的近乎完整组装

拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组序列作为广泛应用的模式物种，为植物分子生物学研究提供了巨大的推动力。在基因组序列首次发布后的20多年（Arabidopsis Genome Initiative, 2000）之后，仍然存在一些未解决的间隙区域，这些区域可能由高度重复的序列组成，如端粒、着丝粒、5S rDNA簇和含有45S rDNA的核仁组织区（NOR）。使用相对较短的测序读取来组装这些重复序列非常困难。对广泛使用的TAIR10/Araport11组装（Lamesch等，2012）进行扫描时，发现了165个间隙，涵盖了所有五个着丝粒，并且没有一个染色体可以从头到尾完成。本文展示了一种高质量的组装，包含三个无间隙的染色体和两个只缺少NORs和NOR4末端端粒序列的染色体。通过结合长读取Oxford Nanopore Technologies（ONT）、高保真长读取PacBio和短读取Illumina技术，我们获得了一个新的133,917,231-bp的Col-0基因组组装，命名为Col-PEK，比TAIR10/Araport11组装大14,770,883 bp。此外，我们还填补了最近发布的两个高质量组装Col-CEN和Col-XJTU中大部分剩余的间隙（Naish等，2021；Wang等，2021）。在这个近乎完整的基因组组装中，共注释了27,629个蛋白质编码基因，其中213个是新发现的。这些新基因中的许多位于NORs或着丝粒区域。值得注意的是，我们发现至少有145个新基因是由于之前未被识别的隐藏重复而产生的，包括串联重复，这大大扩展了我们对近期基因重复的理解。在五个完整的着丝粒中，我们观察到178-bp串联卫星DNA重复序列（CEN180）的数量远高于之前的假设。

我们整合了Nanopore ONT、PacBio HiFi和Illumina NovaSeq的读取，用于初步组装、修饰和去污染。随后，我们在TAIR10的框架内将contig定位到染色体水平，然后使用HiFi contig/scaffold填补Chr4上的两个间隙。通过填补所有间隙并定位到TAIR10，我们得到了相同的结果。最后，我们基于仅使用ONT读取的区域修正了结构错误和小型拼接错误，并通过HiFi contig和读取比对检查了NORs中的潜在缺失。最终的Col-PEK组装大小为133,917,231 bp，所有着丝粒已完成（补充方法；补充图1）。

通过基准通用单拷贝同源基因（Supplemental Table 1）、核心真核基因映射方法评估（Supplemental Table 2）、GC-深度分析（Supplemental Figure 2）、Merqury（Rhie等，2020）和Inspector（Chen等，2021）评估（补充方法；补充表3和4）、SNP分析（Supplemental Table 5）以及使用原始Illumina过滤读取、HiFi读取和ONT读取的比对（补充方法；补充图3和4）确认了组装质量的高水平。值得注意的是，Merqury评估表明，Col-PEK的质量明显高于TAIR10和Col-CEN，并且与Col-XJTU的质量相当或略高（补充表3）。所有来自着丝粒区域的测序读取都通过CEN180特异性11-mer序列得到了验证，Merqury对五个着丝粒的评估显示出极高的准确性，Chr2（CEN2）的错误率低至0（补充方法；补充表4）。我们将Col-PEK与TAIR10、Col-XJTU和Col-CEN组装（Naish等，2021；Wang等，2021）进行了比较，发现完美的共线性（图1A–1C；补充图5A和6）。新的组装添加了大约14.8 Mb的新序列，这些序列大多位于着丝粒附近或内部（图1A；补充图5A和7–11）。除了着丝粒之外，我们还在Chr2和Chr4的顶部臂末端分别添加了约499和约183 kb的序列（补充图1和7–11）。序列比对表明，这些新序列包含45S rDNA亚单位（即5.8S、18S和25S rDNA）（补充表6），提示它们是NORs的一部分（Sims等，2021）。尽管长度明显大于TAIR10（>98.55%），两个NOR仍包含一些未完成的间隙（补充方法）。我们进一步应用覆盖度分析来估算重复序列的拷贝数，使用Illumina读取（Long等，2013）。估算的45S rDNA的拷贝数（>310）远大于组装单元的数量（约66）（补充表6），提供了NOR大小的估算值。我们还在Chr2的NOR附近鉴定了2.6 kb的端粒重复序列，而Chr4的NOR仍然缺乏端粒重复序列。总共识别出了九个端粒，大小从2.6 kb到3.6 kb不等（补充表7）。

**图1. Col-PEK组装、注释及应用概览**

**(A)** 使用MUMmer比对Col-PEK、Col-XJTU、Col-CEN与TAIR10之间的序列共线性。每个共线区域表示一对一的比对关系。图中从左到右连接的染色体分别为Chr1至Chr5。
 **(B 和 C)** Col-PEK与Col-XJTU (B) 或Col-CEN (C) 在Chr2上的共线性比较。两个黑色框表示在Col-XJTU和Col-CEN中存在的间隙。
 **(D)** Col-PEK基因组组装的注释，除(h)外，其他内容均按100 kb窗口统计。

- (a) 染色体长度与着丝粒区域（灰色）以及线粒体DNA插入区域（蓝色），染色体Chr1至Chr5按顺时针排列；
- (b) 编码基因数密度；
- (c) 所有重复序列密度；
- (d) CEN180单体密度；
- (e) LTR类转座元件密度；
- (f) DNA类转座元件密度；
- (g) 由GMATA和TRF识别的SSR与串联重复序列的综合密度（补充方法）；
- (h) 通过Nanopolish基于ONT数据检测的高频CpG甲基化位点密度（以50 kb窗口）；
- (i) 新识别的145个基因与其高度同源基因的共线关系。绿色线表示同一染色体上的基因，红色线表示分布在不同染色体上的基因。
   **(E)** Col-PEK在Chr1上识别出Col-CEN中错误组装的区域，包含一个36.0 kb的缺失序列及七个编码基因。图中每个矩形代表一个基因，同一面板中颜色相同表示同源基因。虚线表示Col-CEN中缺失的序列。
   **(F)** 一个新预测基因的示例，暂定命名为PEK_AT5G29578，位于新组装的Chr5着丝粒中。该基因获得RNA测序支持，最大比对深度为467×。图底部黑色条带表示预测的基因结构；粗条带为预测外显子，细条带为预测内含子。

与最近发布的高质量组装（Col-CEN与Col-XJTU）相比，Col-PEK组装更完整、长度更长，并填补了多个长度超过40 kb的剩余间隙（图1A–1C；补充图3与6；补充表8与9；补充方法）。例如，Col-XJTU在Chr2上留下的一个108.7 kb间隙已被填补（图1B；补充图3A与12A）。在Col-CEN中，一个232.8 kb的不明间隙现已在Chr2的线粒体DNA插入区被识别并填补。插入后的mtDNA大小（640.5 kb）与之前荧光原位杂交估计值（618 ± 42 kb）以及Col-XJTU报告的值一致（图1C和1D；补充图3B、12B和13）。我们还在Col-CEN的Chr1上识别到一个36.0 kb的间隙，包含七个编码基因（图1E；补充图3C、6B和12B）。这些新序列都得到了ONT和HiFi读取的良好支持（补充图3）。这些分析解释了Col-PEK中Chr2、Chr4和Chr5（NOR除外）序列为何长于Col-XJTU和Col-CEN（补充表8）。另一方面，Col-PEK中的Chr1和Chr3略短于Col-XJTU，可能是由于Col-PEK中缺失了部分序列。为此，我们评估了Chr1中的一个21 kb区域（补充图4A–4E）和Chr3中的一个11 kb区域（补充图4F），并发现ONT通过读取和HiFi读取在Col-PEK断点处有连续覆盖，而在Col-XJTU断点处则没有。值得注意的是，在这些区域，Col-PEK与Col-CEN的序列完全一致（补充图4）。

Col-PEK组装为估算重复序列的分布提供了前所未有的机会。我们识别出26,079个简单序列重复，总长度400,090 bp，识别出46,108个串联重复，总长度15,470,062 bp。随后，使用RepeatMasker（http://www.repeatmasker.org/）预测转座元件，发现约有19,274,191 bp（占基因组的14.40%）归属于转座元件。其中，LTR/Gypsy类逆转录转座元件是最大的类群，占6,885,521 bp（占基因组的5.14%）。重复序列的总占比为26.58%，远高于TAIR10的18.51%（图1D；补充图14；补充表8和10）。

共有27,416个蛋白质编码基因从Araport11转移到了Col-PEK中，总数为27,445个。剩余的基因要么位于TAIR10中错误组装的区域，要么太短（3-39 bp）（补充图15和16；补充表11；补充方法）。例如，AT3G41762在TAIR10中的26 kb错误组装区域中被发现，但也有四个同源拷贝，它们被重新组装到Col-PEK的NOR2和NOR4中（补充图15；补充表11和12）。先前的研究也建议，TAIR10中的这个区域可能存在问题（Pucker等，2021）。值得注意的是，我们识别出145个之前未知的基因，它们与现有基因具有高度相似性（>99% DNA序列相似性）（图1D，内圈；补充表12；补充方法）。在这些隐藏重复的基因中，70个位于两个NORs中，47个位于前述的线粒体DNA插入区域（补充图7–11）。根据TAIR提供的同源基因功能描述，这部分基因推测编码线粒体呼吸途径的蛋白质。至少56个新识别的隐藏重复基因形成了串联重复，其中两个或多个同源基因沿染色体相邻排列（图1D，内圈；补充表12）。以前也曾发现有限的隐藏基因重复现象，例如SEC10（Vukašinović等，2014）（补充图16A），而我们的发现表明这种现象更为常见（补充方法；补充表12）。不同的重复基因可能会相邻排列。例如，Chr5中一个最近更新的区域包含两种基因重复，一种是一个基因重复两次，另一种是一块三基因区域重复一次（补充表12），支持了最近的报告（Pucker等，2021）。为了进一步识别新序列中的基因，我们采用了三种独立的方法，包括基因预测、同源搜索和参考引导的转录组组装，获得了另外68个新编码基因，其中17个基因得到了转录组数据的支持（图1F；补充图7–11；补充表13）。这些新基因大多位于NORs和线粒体DNA插入区，一部分则分布在被着丝粒特异性组蛋白H3样蛋白（CENH3）结合的着丝粒区域（补充图7–11）。

由于其更高的完整性，Col-PEK在识别的非编码RNA（ncRNA）基因数量上超过了Col-CEN和Col-XJTU。总共识别出5,959个ncRNA基因，包括3,910个编码5S rRNA、71个编码18S rRNA、64个编码25S rRNA、66个编码5.8S rRNA、648个编码tRNA，以及1,200个编码其他ncRNA，包括核糖开关和核糖酶（补充表6）。值得注意的是，我们的分析显著增加了5S rRNA的数量（补充表6和8），并揭示了许多5S rRNA集中在Chr3至Chr5的着丝粒附近，并与LTR/Gypsy元素交替排列（补充图7–11）。PacBio HiFi数据有助于填补Chr4上的间隙，并恢复易于丢失的重复序列，如5S rDNA和CEN180阵列，从而确保Col-PEK在注释这些重复元素上的优势（补充图17；补充方法）。

五个完整的着丝粒为细致分析着丝粒组织提供了独特的机会。我们共识别出66,232个着丝粒CEN180重复序列，这一数字超过了Col-CEN和Col-XJTU组装中的数量（图1D；补充图7–11；补充表8）。每个着丝粒中的CEN180阵列体积从2.36 Mb到4.40 Mb不等。CENH3结合在以CEN180重复簇为中心的扩展区域，定义了功能性着丝粒。我们发现CENH3结合区域的长度大致与先前通过物理图谱估算的着丝粒大小一致（Hosouchi等，2002；Kumekawa等，2000, 2001），并且与Col-XJTU一致，但比Col-CEN的CENH3结合区域长约1.82 Mb（补充表14）。在所有染色体中，CENH3在着丝粒核心区域富集，在LTR/Gypsy富集的区域则较少。此外，CENH3与某些CEN180子集表现出优先结合的关系。Nanopore ONT测序为检测DNA甲基化提供了机会，这与亚硫酸盐测序结果高度相关。我们发现NORs和5S rDNA阵列高度甲基化，而着丝粒区域的CpG甲基化水平高于染色体臂，尽管CEN180阵列相对低甲基化。此外，端粒区域则呈现低甲基化状态（图1D；补充图7–11和18）。

总之，结合其他最近报告的高质量组装（Naish等，2021；Wang等，2021），新获得的近完整的Col-PEK组装为拟南芥Col-0提供了一个长期期待的关键资源。Col-PEK的在线信息门户，包括互动式可搜索浏览器以及可下载的基因组组装和注释文件，已上线，网址为：http://col-pek.arashare.cn/。

官网

拟南芥参考基因组_拟南芥数据库-CSDN博客

Ensembl数据库下载参考基因组（常见模式植物）bioinfomatics 工具37_ensembl plant数据库-CSDN博客

 http://col-pek.arashare.cn/