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近日，西北农林科技大学博士后金妙函等为第一作者，陈玉林教授和王小龙教授为通讯作者，在国际知名期刊《Journal of Advanced Research》上发表题为“Efficient derivation of stable sheep embryonic stem cells opens a new avenue for agricultural and biomedical application”的研究论文。研究团队建立了一种名为TePR（mTeSR PLUS培养基联合WNT/β-catenin通路抑制剂IWR-1）的新型培养系统，首次实现绵羊胚胎干细胞系（Embryonic Stem Cells, ESCs）的长期稳定培养。具体而言，通过整合绵羊胚胎发育各阶段的多组学数据（包括Smart-seq2、ATAC-seq和WGBS），系统描绘了绵羊早期胚胎发育和ESCs多能性状态的转录组与表观遗传特征。易基因科技为本研究提供Smart-seq2、ATAC-seq和WGBS技术支撑，助力揭示绵羊ESCs独特的转录特征、染色质开放状态和甲基化模式，为理解反刍动物早期发育和干细胞多能性调控机制提供重要见解。
标题：Efficient derivation of stable sheep embryonic stem cells opens a new avenue for agricultural and biomedical application（构建高效稳定的绵羊胚胎干细胞系，开启农业和生物医学应用新途径）
发表时间：2025年7月23日
发表期刊：Journal of Advanced Research（J Adv Res）
影响因子：IF13/Q1
技术平台：Smart-seq2、ATAC-seq和WGBS（易基因金牌技术）
作者单位：西北农林科技大学
DOI：10.1016/j.jare.2025.07.036
胚胎干细胞系（ESCs）可分化为所有成体细胞类型，在农业和生物医学领域具有变革性潜力。然而，绵羊稳定ESCs的分离仍然具有挑战性，限制其在进一步研究中的应用。本研究旨在通过简化方案建立稳定的绵羊ESCs，保留其多能性。通过含有IWR-1的培养系统（称为TePR）从囊胚内细胞团中分离绵羊胚胎干细胞。通过长期培养（>100代）、三胚层分化、转录组分析（E0-E6胚胎）和跨物种比较来评估多能性。其中，转录组学显示TePR条件下分离培养的绵羊胚胎干细胞系（称为TePR-sESCs）与8细胞/桑椹胚相似，且与绵羊基因组激活时间一致。此外，ATAC-seq揭示了其多能性基因（如POU5F1、NANOG）的染色质可及性。WGBS鉴定出多能性相关区域的低甲基化。TePR-sESCs在长期培养后仍保持正常核型、核心多能性基因表达（如POU5F1、NANOG）和三胚层分化能力，且耐受多轮基因编辑（如mCherry敲入和MSTN基因敲除），为农业育种和生物医学研究提供重要工具。
图形摘要
易小结
本研究不仅在绵羊胚胎干细胞领域取得了重要突破，还通过应用和拓展表观基因组学和单细胞转录组学测序技术，为反刍动物干细胞研究、农业和生物医学应用以及表观遗传学研究提供了新的工具和方法。这些成果不仅具有重要的科学价值，还为未来相关领域的研究提供了重要的参考和启示。
易基因提供的Smart-seq2、ATAC-seq和WGBS等多组学整合技术支撑，不仅能够获得更全面的生物学信息，还能揭示不同组学层面之间的相互作用和调控机制。这一研究为未来多组学整合研究提供成功思路，展示了其在复杂生物系统研究中的巨大潜力。
易基因相关拓展性案例展示
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- Nature | 易基因DNA甲基化测序助力人多能干细胞向胚胎全能8细胞的人工诱导
研究方法
胚胎收集与培养：从雌性绵羊体内收集胚胎，并在体外培养至不同发育阶段。
ESC的分离与培养：TePR条件下从囊胚内细胞团中分离绵羊ESC，并进行长期培养。
转录组分析（Smart-seq2）：对绵羊植入前胚胎（卵母细胞至囊胚共7个阶段）和ESC进行单细胞转录组测序，分析其基因表达谱，揭示胚胎基因组激活（Embryonic Genome Activation, EGA）动态。
染色质开放性分析（ATAC-seq）：比较TePR-sESCs与绵羊胎儿成纤维细胞（Sheep Fetal Fibroblasts, SFFs）的染色质开放区域，识别多能性相关转录因子结合 motif（如POU5F1、SOX2）。
全基因组甲基化分析（WGBS）：对ESC和成纤维细胞进行WGBS，分析DNA甲基化模式，定位差异甲基化区域（DMRs）。
基因编辑：利用PiggyBac转座和CRISPR/Cas9技术对ESC进行基因编辑，验证其基因编辑能力。
嵌合体实验：将ESC注入早期囊胚，观察其在嵌合体胚胎中的贡献。
结果图形
（1）TePR培养基支持绵羊ESC系的构建和长期稳定培养
研究者测试了四种不同的培养条件（NBFR、bEPSCM、3i/LAF和TePR），发现TePR条件下的绵羊ESC（TePR-sESCs）能够成功构建并长期稳定培养。TePR-sESCs展现出稳定的形态，能够在单细胞水平上传代，并在超过100代后保持未分化状态。这些细胞表达多能性标记基因（如POU5F1、SOX2和NANOG），并通过胚胎体（EB）分化实验显示出三胚层分化潜力。这些结果表明，TePR培养基能够支持绵羊ESC的建立和长期稳定培养，为后续研究提供可靠的细胞模型。
图1：TePR-sESCs的生成与表征
- TePR-sESCs从第6天体内受精胚胎中分离的示意图。
- TePR-sESCs的明场图像和碱性磷酸酶（AP）染色。
- TePR-sESCs的核型分析。
- 使用RT-qPCR分析TePR-sESCs的核心多能性基因（POU5F1、SOX2、NANOG、LIN28和SALL4）的基因表达。
- TePR-sESCs（P10）和TePR-sESCs（P100）的单细胞克隆效率。
- 体外胚状体（EB）分化实验。通过RT-PCR检测外胚层（OTX2、PAX3、KRT8和NESTIN）、中胚层（PDGFRA和ACTA2）和内胚层（FOXA2和GATA6）特异性基因的表达。
- 体内畸胎瘤形成实验。TePR-sESCs形成的畸胎瘤的H&E染色。
- 免疫染色检测POU5F1、SOX2、NANOG、SSEA4、TRA-1–81和TRA-1–60。
- 免疫染色检测AFP、GATA6、SMA、Nestin和Tublin。
（2）TePR-sESCs的转录组表征
通过单细胞转录组Smart-seq2分析显示，绵羊EGA发生于8细胞期至桑椹胚阶段。TePR-sESCs的转录组特征与8细胞/桑椹胚胚胎高度相似，但多能基因表达模式存在差异：如POU5F1在桑椹胚中高表达，而在TePR-sESCs中下调。差异表达基因（DEGs）富集于WNT/BMP信号通路、胚胎器官形态发生等，提示TePR-sESCs处于一种接近胚胎早期发育的多能状态，这些结果揭示了TePR-sESCs独特的转录组特征。
图2：TePR-sESCs的转录特征分析
- 转录组测序示意图。
- 样本相关性热图（MII卵母细胞、受精卵、2细胞期、8细胞期、桑椹胚、早期囊胚、晚期囊胚以及TePR-sESCs）。
- 不同胚胎阶段（MII卵母细胞、受精卵、2细胞期、8细胞期、桑椹胚、早期囊胚、晚期囊胚以及TePR-sESCs）的基因表达水平。
- TePR-sESCs与不同胚胎阶段的主成分分析。
- 8细胞期胚胎、桑椹胚和TePR-sESCs中标记基因表达的箱线图。
- 8细胞期胚胎与TePR-sESCs之间差异表达基因（DEGs）的火山图。
- 8细胞期胚胎与TePR-sESCs之间差异表达基因（DEGs）的GO富集分析。
- 桑椹胚与TePR-sESCs之间差异表达基因（DEGs）的火山图。
- 桑椹胚与TePR-sESCs之间差异表达基因（DEGs）的GO富集分析。
（3）TePR-sESCs的表观遗传表征
利用ATAC-seq和WGBS技术，研究者分析了TePR-sESCs的染色质可及性和DNA甲基化模式。ATAC-seq结果显示，TePR-sESCs的染色质可及区域显著多于成纤维细胞，且这些区域富含多能性转录因子（如POU5F1、SOX2和NANOG）的结合位点。WGBS结果显示，TePR-sESCs的DNA甲基化水平约为82%，与人类、猪和牛的EPSCs相似。这些结果表明，TePR-sESCs具有独特的表观遗传特征，这些特征可能与其多能性状态密切相关。
ATAC-seq：TePR-sESCs的染色质开放区域（DARs）显著多于绵羊胎儿成纤维细胞（SFFs），且富集于多能基因启动子区（如POU5F1、NANOG）（图3A-D）。差异可及性基因参与cAMP/WNT信号通路（图3E），表明表观遗传调控与多能性维持密切相关。
WGBS：TePR-sESCs全基因组甲基化水平约82%，与人类、猪和牛等物种的primed ESCs相似（图3F）。DMRs主要位于基因间区和内含子区，且与TSS邻近区域的染色质可及性呈负相关（图3H），印证了DNA甲基化对基因表达的抑制作用。
图3：TePR-sESC的表观遗传表征。
（A）TePR-sESC和SFF的总ATAC-seq水平。
（B）TePR-sESC和SFF之间不同基因组区域（启动子、内含子、编码外显子和远端基因间区域）内DAR分布。
（C）每个基因组区域中DAR丰度小提琴图。
（D）TePR-sESCs和SFF中ATAC-seq peaks的motif富集分析。
（E）与SFF相比，TePR-sESC中富集具有不同染色质可及性的基因通路。
（F）TePR-sESC和SFF的DNA甲基化水平。
（G）TePR-sESC和SFF之间不同基因组区域（启动子、外显子、基因间和内含子区域）内DMR的分布。（H）转录起始位点的平均DNA甲基化水平和DAR分布（TSS±3Kb）。
（4）TePR-sESCs的特异性基因网络
通过整合多组学（DEGs+DARs+DMGs）数据，研究团队鉴定出13个在TePR-sESCs中具有特异性表达模式基因（如PDE4D、SIX6、MECOM和TBX18）。这些基因在cAMP、MAPK、细胞间连接和Ras信号通路中富集。此外研究者还分析了TePR-sESCs与其他物种（猪、牛）ESC的转录组数据，发现TePR-sESCs与人类naive ESCs的表达模式最为接近。这些结果揭示了TePR-sESCs特异性的基因网络特征，为研究绵羊胚胎发育和ESC多能性提供了新视角。
图4：TePR-sESC的特定基因网络特征
（A） 比较 TePR-sESC、pEPSC、bESC、hNaive ESC、hEPS 和 hPrimed ESC 的 PCA 分析。
（B）TePR-sESC、pEPSC、bESC、hNaive ESC、hEPS和hPrimed ESC的维恩。
（C）TePR-sESCs独特表达基因的GO富集分析。
（D）TePR-sESCs和SFFs中印记基因的表达。
（E）TePR-sESCs和SFFs中组蛋白基因的表达水平。
（F）TePR-sESCs和SFFs的DMR、DAR和DEG重叠。
（5）WNT信号通路维持TePR-sESCs多能性
研究者发现，WNT信号通路抑制剂IWR-1对于维持TePR-sESCs的多能性至关重要。去除IWR-1会导致细胞形态改变、碱性磷酸酶（AP）染色减弱以及多能性标记基因表达下降，而用同类型抑制剂XAV939替代后不会影响细胞的多能性。这些结果强调了WNT信号通路在维持TePR-sESCs多能性中的关键作用。
图5：WNT信号通路抑制剂维持TePR-sESCs的多能性
（A）比较IWR-1缺失和XAV939添加条件下培养的TePR-sESCs的形态与AP染色。
（B）qRT-PCR对多能性相关基因mRNA表达水平的定量分析。
（C）POU5F1、SOX2和NANOG的免疫荧光染色结果。
（6）TePR-sESCs实现精准基因编辑
研究者利用PiggyBac技术在TePR-sESCs中成功敲入mCherry基因，并通过CRISPR/Cas9技术敲除肌肉生长抑制素（MSTN）基因。Sanger测序和深度测序结果显示，基因编辑效率高达93.9%和97.4%。Western blotting结果表明，编辑后的细胞不表达MSTN蛋白。此外，这些基因编辑后的细胞仍保持多能性。这些结果表明，TePR-sESCs能够耐受多轮基因编辑，为农业和生物医学应用提供了强大的工具。
图6：TePR-sESCs的基因编辑表现
（A）基因编辑流程示意图。
（B）mCherry标记的TePR-sESCs荧光图像。
（C）MSTN基因敲除（MSTN-/-）的TePR-sESCs图像。
（D）MSTN-/- TePR-sESCs的编辑效率统计。
（E）MSTN-/- TePR-sESCs的Western blotting检测结果，验证MSTN蛋白表达缺失。
（F）MSTN-/- TePR-sESCs中多能性基因的qRT-PCR分析。
结果和启示
本研究通过整合Smart-seq2、ATAC-seq和WGBS技术，首次系统地描绘了绵羊早期胚胎发育和ESC多能性状态的分子与表观遗传全景图。研究揭示了绵羊ESC独特的转录和表观遗传特征，并成功实现了基因编辑。这些结果不仅增进了我们对反刍动物早期发育和干细胞多能性调控机制的理解，还为未来的农业和生物医学研究提供了新的工具和方法。未来的研究可以进一步探索这些技术在其他物种中的应用，以揭示更多关于胚胎发育和干细胞多能性的奥秘。
关于易基因单细胞转录组测序（smart-seq2）
10X Genomics公司Chromium解决方案无法满足某些特殊或者微量细胞样本甚至单细胞转录组研究。Smart-seq2技术在单细胞水平对带Poly（A）的RNA进行全长转录组扩增及高通量测序，能够满足高灵敏度、低偏好性的cDNA扩增，得到全长转录本，实现高水平的序列模板转换。
Smart-seq2技术有较好的覆盖范围，可检测到稀有转录本，无需额外的专业设备，应用范围较广，可以解决传统 RNA 定量技术在早期胚胎发育、干细胞、癌症、免疫等研究领域中存在的样品量极低或细胞异质性的问题，是在单细胞水平研究基因表达强有力的工具，极大地拓展了RNA-seq 的应用范围。
技术优势：
（1）起始量低：1-1000个细胞或10pg-10ng total RNA即可高效扩增；
（2）转录本覆盖度高：通过双端引物扩增全长cDNA，获得全转录组信息，避免3’端和5’端偏好性，产物完整性好；
（3）检测灵敏度高：大幅度增加了低表达基因的检出量;
（4）碱基分辨率高：可达单碱基分辨率，且可以定位到具体基因的具体转录本;
（5）实验可控：质控点多，可从实验的开端判断细胞状况。
研究方向：
可应用于细胞分子机制中细胞异质性研究，解决因样本量少而无法进行高通量测序的情况。
- 免疫学研究
- 肿瘤及微环境研究
- 绘制组织精细化表达图谱
- 早期胚胎发育
关于易基因全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）
全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。
易基因全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。
应用方向：
WGBS广泛用于各种物种，要求全基因组扫描（不错过关键位点）
- 全基因组甲基化图谱课题
- 标志物筛选课题
- 小规模研究课题
技术优势：
- 应用范围广：适用于所有参考基因组已知物种的甲基化研究；
- 全基因组覆盖：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱；
- 单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态。
| 技术类型 | 起始量 | 特点 | 覆盖度 |
|---|---|---|---|
| 常规WGBS | 1μg gDNA | 正常BS建库技术 | 95% |
| Micro DNA-WGBS | 1-10000个细胞/1ng基因组DNA | 在常规WGBS技术上进行技术改进，使得起始量大大降低，适合珍稀样本的研究 | 95% |
| scWGBS | 单细胞/1-10个细胞 | 克服了组织内部细胞异质性的影响，可以满足单个细胞层面的课题研究 | 20% |
| Micro DNA-XRBS | 1ng gDNA、单细胞 | 为Micro DNA-WGBS的简化版本，特别适用于大样本量的珍稀样本DNA甲基化研究 | 20M CG |
易基因染色质可及性-转座酶易接近染色质测序（ATAC-seq）
ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing）是通过使用高通量测序对转座酶可接近性核染色质区域进行分析的一种创新表观遗传学研究技术。该技术通过转座酶对某种特定时空下开放的核染色质区域进行切割，进而获得在该特定时空下基因组中所有活跃转录的调控序列。
真核生物的DNA并不是裸露的，而是被包装成核小体形成串珠状结构并进一步被折叠、包装。而基因的转录，需要将这种高级结构解开，使DNA成为可以使各种转录机器与其结合的裸露状态，即形成开放染色质区域。如何鉴定开放染色质区域呢？传统的方法主要是借助和DNase-Seq、MNase-Seq及ChIP-seq。但这些方法需要的起始细胞量较大，对于少量样本和珍稀样本可行性不高。ATAC-Seq是一种新型的研究开放染色质的技术，利用Tn5转座酶进入并切割裸露的DNA，并同时连接上特异性的测序接头。因为切割和加接头一步完成，因此该技术可大大降低所需细胞起始量。
技术优势：
（1）所需细胞起始量低。
（2）应用范围广，适用于大部分物种及细胞类型。
实验策略：
信息分析：
易基因除单细胞转录组学外，还专注提供全面的表观基因组学（DNA甲基化、DNA羟甲基化、cfDNA）和表观转录组学（m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C、RNA与蛋白互作）、DNA与蛋白互作及染色质开放性技术方案（ChIP-seq、ATAC-seq），更多表观组学或多组学研究可关注易基因公众号、网站、市场微信号等，期待与各位老师开展合作交流。详询易基因：0755-28317900。
参考文献：Jin M, Huang S, Zhou S, Shen W, Cao J, Song S, Wei Y, Kalds P, Hua J, Ma B, Ross PJ, Wang X, Chen Y. Efficient derivation of stable sheep embryonic stem cells opens a new avenue for agricultural and biomedical application. J Adv Res. 2025 Jul 23. doi: 10.1016/j.jare.2025.07.036.
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