AbMole新生大鼠脑类器官培养Protocol

近日，希腊亚里士多德大学塞萨洛尼基分校的研究团队在《神经科学方法》（Journal of Neuroscience Methods）期刊上发表了一项引人注目的研究，他们开发了一种基于新生大鼠脑组织的新型类器官培养协议，并展望其在阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease, AD）研究中的应用前景。这项研究不仅揭示了大脑发育的奥秘，更为神经退行性疾病的研究提供了新的思路。

Y-27632 dihydrochloride | 129830-38-2 | AbMole | Y27632; Y-27632 2HCl

研究背景：从二维到三维的跨越

在传统的研究中，科学家们往往依赖于二维细胞培养模型来探索细胞的生物学特性。然而，这种模型在模拟复杂生物系统方面存在明显的局限性，尤其是在研究大脑这样高度复杂且多维度的器官时。为了更真实地模拟大脑环境，三维细胞培养系统应运而生，其中类器官作为最具代表性的模型之一，正逐渐成为神经科学研究的新宠。

类器官是由干细胞或多能干细胞在特定条件下自发组织形成的三维细胞团块，它们能够模拟体内器官的部分或全部功能。在神经科学领域，脑类器官因其能够模拟大脑的三维结构和细胞间的复杂相互作用而备受关注。然而，当前脑类器官的培养协议多依赖于干细胞诱导分化，不同协议间因使用的生长因子不同而导致类器官组成各异，这在一定程度上限制了其一致性和可重复性。

研究创新：基于新生大鼠脑组织的类器官培养

为了克服现有培养协议的局限性，研究团队提出了一种新颖的培养方法，旨在利用新生大鼠（3天龄）全脑组织中的多样化细胞类型，通过一步法酶解消化和三维培养，快速生成结构一致、功能完整的脑类器官。

详细protocol流程

实验材料准备：研究团队精心准备了包含多种营养因子的DMEM/F12培养基，如GlutaMax、Hepes、青霉素/链霉素等，以确保细胞的健康生长。同时，他们还准备了用于后续细胞类型鉴定和功能分析的一系列高质量抗体。
实验动物处理：实验选用了Wistar大鼠的3天龄幼崽，通过无麻醉的断头法处死，迅速收集脑组织。在无菌条件下，研究团队仔细去除了脑膜、血管等杂质，确保后续实验的准确性。
细胞分离与培养：将收集到的脑组织切成小块后，研究团队利用酶解消化法将其分解成单细胞悬液。经过过滤和离心处理后，这些细胞与基底膜提取物（BME）按一定比例混合，并均匀接种于培养板中。在含有丰富营养物质的培养基中，这些细胞逐渐生长并形成半球形的类器官结构。整个培养过程持续28-32天，期间需要定期更换部分培养基以维持细胞的健康生长。
类器官鉴定与功能分析：为了验证类器官的结构和功能特性，研究团队进行了一系列精细的实验。首先，通过苏木精-伊红染色（HE染色），他们观察到了类器官中细胞的有序排列和致密结构。接着，利用多种特异性抗体（如抗NeuN用于标记神经元、抗GFAP用于标记星形胶质细胞、抗Iba1用于标记小胶质细胞、抗SOX2用于标记神经干细胞等），研究团队通过免疫荧光染色技术清晰地展示了这些细胞在类器官中的分布和形态。此外，他们还通过Western blot分析检测了类器官中多种与阿尔茨海默病密切相关的蛋白表达水平（如APP、Aβ、tau、GFAP以及IL-1β等），并进一步探讨了类器官对神经炎症的响应性。

实验结果与分析：类器官的“大脑”特性初现端倪

研究团队通过一系列精心设计的实验，深入探讨了新生大鼠脑类器官的结构和功能特性。HE染色结果显示，类器官呈现出致密的细胞结构和有序的组织排列，这表明它们已经初步具备了大脑的某些特征。更重要的是，免疫荧光染色和Western blot分析结果显示，类器官中包含了多种与大脑功能密切相关的细胞类型（如神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和神经干细胞等），并且这些细胞能够表达多种与阿尔茨海默病密切相关的蛋白（如APP、Aβ、tau等）。此外，在脂多糖（LPS）刺激下，类器官中炎症因子IL-1β的表达水平显著上调，这表明类器官对神经炎症具有敏感的反应性。这些结果不仅证明了类器官在结构上与大脑具有相似性，也为其在功能上模拟大脑提供了有力支持。

研究意义：开启神经科学研究新篇章

这项研究的意义在于它提出了一种简单、高效且成本效益高的类器官培养协议，为神经科学研究提供了新的工具和方法。与传统的干细胞诱导分化方法相比，这种基于新生大鼠脑组织的培养协议无需使用多种生长因子和复杂的培养条件即可生成结构一致、功能完整的脑类器官。这不仅降低了实验成本和时间成本也提高了类器官的一致性和可重复性。此外该研究还展示了类器官在阿尔茨海默病研究中的潜在应用前景为探索该疾病的发病机制提供了新的思路和方法。

未来展望：探索大脑的无限可能

展望未来随着生物技术的不断进步和类器官培养技术的不断完善我们有理由相信类器官将在神经科学研究中发挥越来越重要的作用。通过进一步优化培养协议和引入更先进的分子生物学技术（如CRISPR-Cas9基因编辑技术）科学家们可以生成更加复杂和多样化的类器官模型来模拟不同的大脑区域和疾病状态。这将有助于我们更深入地理解大脑的生理和病理机制以及神经退行性疾病的发病机制。同时类器官还可以作为药物筛选和毒性测试的平台来加速新药研发进程为治疗神经退行性疾病提供新的希望。

以下是一种大鼠脑类器官开发的 protocol：

一、材料与方法

培养基：使用 Advanced DMEM/F12 培养基，添加 GlutaMax、Hepes、青霉素/链霉素、Primocin、R-spondin、B27 补充剂、N-乙酰半胱氨酸、SB 202190、A83-01、烟酰胺、Y-27632、Noggin、FGF-7 和 FGF-10 等成分。
实验动物：3 日龄的 Wistar 大鼠幼崽。
细胞分离：将幼崽断头处死后，迅速取出大脑组织，用胶原酶 II 处理以分离细胞，通过过滤和离心获得单细胞悬液，再用红细胞裂解缓冲液去除红细胞。
类器官培养：将细胞与基底膜提取物（BME）按 1:1 混合，接种于 24 孔板中，37℃、5% CO₂培养箱中培养，每 3 天部分更换培养基，培养至 32 天。
LPS 处理与细胞裂解液制备：用 1μg/ml 的 LPS 处理培养 32 天的类器官 24h，收集培养基和细胞裂解液进行后续分析。

二、结果与分析

类器官生成与细胞类型鉴定：培养 28 天的类器官经苏木精 - 伊红染色显示结构完整，免疫组化证实存在神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和祖代干细胞。
类器官功能验证：Western Blot 分析显示类器官表达了神经元和胶质细胞的特异性蛋白，如 APP、MAPT、GFAP 等，并能分泌 Aβ 和 IL-1β。
LPS 诱导的 AD 相关蛋白表达与炎症反应：LPS 处理后，类器官中 APP、Aβ、GFAP、MAPT 和 IL-1β 的表达水平显著升高，表明类器官对炎症刺激产生了类似于 AD 的病理反应。