原核表达可溶性蛋白难题破解
在生物医药、疫苗研发、结构生物学和酶工程等领域，重组蛋白的表达与纯化是基础性技术之一。其中，原核表达系统因其高效、成本低廉而成为研究和工业生产中的首选平台。然而，如何获得高可溶性、功能完整的重组蛋白，仍然是科研人员面临的重大挑战。
一、原核表达系统概述
原核表达系统主要以大肠杆菌（Escherichia coli）为代表，利用其快速的生长速度和高效的蛋白合成能力，进行外源基因的表达。该系统的优势包括：培养条件简单、表达量高、成本低廉、操作简便。然而，原核系统也存在一些局限性，尤其是在表达高分子量、复杂结构或具有翻译后修饰需求的蛋白时，往往导致蛋白质聚集形成包涵体，影响其可溶性和功能性。因此，如何提高原核表达系统中蛋白的可溶性，成为了研究的热点。
二、影响原核表达可溶性蛋白的因素
1. 蛋白质本身的特性
蛋白质的氨基酸序列、分子量、疏水性、二级结构等特性直接影响其在原核系统中的表达和溶解性。高疏水性、丰富的β-折叠结构和大分子量的蛋白更容易形成包涵体。
2. 表达载体与启动子系统
表达载体的选择、启动子的强度以及诱导条件都会影响蛋白的表达水平和溶解性。强启动子和高诱导浓度虽然能提高表达量，但也可能导致蛋白快速积累，增加包涵体的形成。因此，优化表达载体和启动子系统，合理控制诱导条件，是提高蛋白可溶性的关键。
3. 培养条件
培养温度、培养基成分、诱导时间和诱导剂浓度等因素都会影响蛋白的表达和溶解性。较低的培养温度有助于蛋白的正确折叠，减少包涵体的形成。例如，采用低温诱导策略，可以促进蛋白溶解，增加可溶性蛋白的几率。
4. 蛋白折叠辅助系统
分子伴侣如GroEL/GroES、DnaK/DnaJ等在蛋白质的正确折叠中起着重要作用。共表达这些分子伴侣可以提高重组蛋白的溶解性和活性。例如，采用共表达GroEL/GroES系统可以显著提高重组蛋白的可溶性和活性。
5. 包含体的处理与溶解
对于已形成的包涵体，采用适当的溶解和重折叠方法，如使用尿素或硫脲溶解包涵体，再通过透析或快速稀释等方法进行重折叠，可以获得具有生物活性的蛋白。然而，稀释复性的复性率低，且存在因二硫键错配导致构象不正确的问题，导致生物学活性降低。
三、解决策略与研究进展
1. 优化表达条件
通过调节培养温度、诱导时间和诱导剂浓度等条件，可以在一定程度上提高蛋白的溶解性。例如，降低培养温度至15-20℃，延长诱导时间，有助于蛋白的正确折叠。
2. 蛋白工程改造
通过基因工程手段，优化蛋白的氨基酸序列，如减少疏水性区域、增加亲水性区域、引入可溶性标签等，可以提高蛋白的溶解性。
3. 共表达分子伴侣
共表达分子伴侣如GroEL/GroES、DnaK/DnaJ等，可以促进重组蛋白的正确折叠，减少包涵体的形成。
4. 包含体的溶解与重折叠
对于已形成的包涵体，采用适当的溶解和重折叠方法，可以获得具有生物活性的蛋白。
5. 新型表达系统的开发
近年来，研究者们开发了多种新型表达系统，如酵母表达系统、昆虫细胞表达系统等，这些系统在某些情况下可以克服原核系统的局限性，获得高可溶性和高活性的重组蛋白。
四、融合标签策略
在原核表达系统中，蛋白质往往因为疏水性高、结构复杂而难以溶解。融合标签（Fusion Tag）技术被广泛应用，常见的可溶性标签包括GST、MBP、SUMO等。融合标签通过改善折叠环境、增加亲水性和提供纯化功能，提高目标蛋白的可溶性和纯化效率。例如，在表达人干扰素α2b（hIFN-α2b）时，通过在N端融合MBP标签，可溶性蛋白量从约10%提升至60%以上，并保持抗病毒活性（Waugh, 2011）。需要注意的是，标签去除后可能影响蛋白稳定性或活性，标签与目标蛋白之间应设计合理的酶切位点。
五、低温诱导与分步表达
低温表达和分步诱导策略是提高蛋白可溶性的经典方法。降低表达温度可减缓翻译速度，使蛋白有更多时间正确折叠，降低聚集速率，并有利于分子伴侣参与折叠。实验显示，将大肠杆菌培养温度从37℃降低至16℃，可显著提高人干扰素β（hIFN-β）的可溶性表达。
分步诱导策略可进一步优化蛋白表达：初期使用低浓度诱导剂启动蛋白表达，随后逐步增加诱导剂浓度，控制翻译速率，提高可溶性。表达含多个二硫键的人胰岛素前体时，采用低温加分步诱导策略，可使可溶性蛋白率由约20%提升至65%，并成功进行体外折叠和活性检测。
低温表达与融合标签策略结合使用效果最佳，例如在表达复合酶或抗体片段时：N端融合MBP标签、低温诱导表达、共表达GroEL/GroES伴侣，能够显著提高可溶性表达量，同时保持蛋白功能。
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