在合成生物学与代谢工程的推动下，微生物细胞工厂已成为 bulk 化学品、高价值天然产物及重组蛋白的核心生产平台 —— 其温和的反应条件、高特异性的催化能力，可大幅降低传统化学合成的污染与能耗。在众多微生物宿主中，酵母因兼具真核生物的翻译后修饰能力与原核生物的易操作性，成为细胞工厂的 “中坚力量”：例如酿酒酵母（S. cerevisiae）可通过细胞器分区（如过氧化物酶体）实现角鲨烯的高效合成，而毕赤酵母（Komagataella phaffii）作为另一类重要酵母，凭借独特的生物学特性，正逐渐成为工业级生产的 “潜力股”。
然而，毕赤酵母的基因改造技术长期落后于模式酵母，传统方法难以满足多基因代谢路径重构的需求。近期研究围绕 “突破基因编辑瓶颈” 展开，通过优化 CRISPR/Cas9 工具、实现大片段整合与敲除、构建多基因组合文库，为毕赤酵母细胞工厂的升级提供了关键解决方案。本文将从毕赤酵母的核心优势、传统技术局限、CRISPR 应用现状及本研究的创新方向四方面，解析其如何向 “高效多基因调控型细胞工厂” 迈进。
一、毕赤酵母：工业级细胞工厂的 “独特优势”
相比酿酒酵母，毕赤酵母的三大核心特性使其在工业应用中脱颖而出，成为异源蛋白与天然产物合成的优选宿主：
1. 安全可控 + 高效翻译后修饰，适配医药与食品领域
毕赤酵母是公认的 GRAS（一般认为安全）菌株，无需担心产物的生物安全性，可直接用于食品添加剂、医药蛋白（如抗体、酶制剂）的生产。更重要的是，它具备与高等真核生物类似的翻译后修饰能力 —— 能精准完成糖基化（如人源化糖链修饰）、磷酸化、二硫键形成等，解决了大肠杆菌无法修饰复杂蛋白的短板。例如，利用毕赤酵母表达的人源干扰素，其糖基化水平与天然干扰素一致，生物活性可达大肠杆菌表达产物的 3 倍以上。
2. 无 Crabtree 效应 + 甲醇诱导调控，支撑高密度发酵
与酿酒酵母不同，毕赤酵母是甲基营养型酵母，且无 Crabtree 效应 —— 即使葡萄糖浓度过高，也不会优先通过无氧呼吸产乙醇（避免碳源浪费），可在基础培养基中实现高密度发酵（细胞干重可达 100 g/L 以上）。更关键的是，其甲醇代谢关键基因（如 AOX1）的启动子是强诱导型启动子：以甲醇为唯一碳源时，不仅能维持细胞生长，还可高效诱导目的基因表达；同时，甲醇会触发毕赤酵母过氧化物酶体的增殖与扩张 —— 这类细胞器可分隔毒性中间产物（如萜类合成中的 IPP 前体），为高附加值天然产物合成提供 “专属反应空间”。
3. 传统应用基础扎实，工业转化门槛低
毕赤酵母已被广泛用于异源蛋白生产（如胰岛素前体、纤维素酶），工业发酵工艺成熟（如 500 L 发酵罐的规模化生产），且基因组测序完成、遗传操作工具相对完善，科研团队无需从零建立培养与改造体系，可快速推进从实验室到工业级的转化。例如，已有研究通过线性质粒插入法，在毕赤酵母中实现非动物源硫酸软骨素的高效合成，为多糖类产品的工业化提供了新路径。
二、传统基因改造的 “瓶颈”：难承多基因代谢工程之重
尽管毕赤酵母优势显著，但传统基因改造方法（以 “单交换整合” 为主）存在两大核心局限，制约了其在多基因代谢路径重构中的应用 —— 而多基因协同调控恰恰是合成复杂天然产物（如萜类、黄酮类）的关键：
1. 可调控基因数量有限，无法覆盖完整代谢路径
单交换整合依赖线性化质粒与基因组的同源重组，通常一次仅能整合 1-2 个基因表达盒。对于需要 5 个以上基因协同表达的代谢路径（如番茄红素合成需 11 个关键酶基因），需分多次进行整合，不仅周期长（每次改造需 2-3 周），还可能因整合位点不同导致基因表达强度失衡，影响产物产量。
2. 筛选标记回收繁琐，迭代改造效率低
毕赤酵母常用的筛选标记（如 G418 抗性基因、Zeocin 抗性基因、KpHis4 营养缺陷基因）缺乏高效的反向筛选机制：传统回收依赖 “非选择性培养基培养下的自然丢失”，成功率仅 30%-50%，且需通过大量菌落 PCR 验证；而模式酵母酿酒酵母可通过 ScURA3 标记的 “5 - 氟乳清酸反向筛选”，实现标记的快速回收（成功率 >90%），两者效率差距显著。
这些局限导致毕赤酵母难以满足 “快速构建多基因协同调控的细胞工厂” 需求，亟需更高效的基因编辑工具。
三、CRISPR/Cas9 的 “应用与落差”：毕赤酵母 vs 酿酒酵母
CRISPR/Cas9 技术因 “简单、高效、精准” 的特性，已被引入毕赤酵母的基因改造，并取得一定进展：例如通过 CRISPR 重构代谢网络，成功实现苹果酸、α- 檀香烯、脂肪酸等化学品的合成；也开发了单位点多片段整合、多位点编辑等技术，初步提升了多基因改造能力。
但与酿酒酵母的 CRISPR 应用相比，毕赤酵母仍存在明显 “落差”，主要体现在两点：
- 大片段整合能力不足：酿酒酵母可通过 CasEMBLR 技术，一次转化在 3 个位点整合 15 个 DNA 片段，支撑复杂代谢路径的快速构建；而毕赤酵母此前的技术最多仅能在单个靶点整合 9 个片段（来自 3 个表达盒），难以覆盖完整的长链代谢路径（如需要 10 个以上基因的萜类合成）。
- 标记回收与筛选效率低：酿酒酵母的 ScURA3 标记可通过反向筛选快速循环利用，支持 5 次以上的迭代改造；而毕赤酵母的标记回收依赖自然丢失，不仅慢，还易导致基因组不稳定，难以实现多轮基因编辑。
这些 “落差” 成为毕赤酵母细胞工厂升级的关键障碍，也是本研究旨在解决的核心问题。
四、本研究的 “破局方向”：四大技术创新，升级毕赤酵母基因编辑工具
针对上述痛点，本研究围绕 “优化 CRISPR 工具、拓展改造能力” 展开，提出四大核心创新方向，为毕赤酵母多基因代谢工程提供新方案：
1. 重构 gRNA 质粒：GFP 赋能筛选与标记回收可视化
研究重新设计 gRNA 表达质粒，引入绿色荧光蛋白（GFP）基因：一方面，GFP 可作为 “阳性转化子筛选标记”—— 仅含正确 gRNA 质粒的细胞会发出绿色荧光，无需 PCR 验证，可通过荧光显微镜或流式细胞仪快速筛选，将转化子鉴定效率提升 2 倍以上；另一方面，GFP 与筛选标记基因串联，标记回收后细胞会失去荧光，实现 “荧光消失” 的可视化鉴定，大幅简化回收验证步骤，解决传统标记回收繁琐的问题。
2. 单位点整合 11 个片段：突破 26 kb 大片段改造
针对多基因代谢路径的整合需求，研究通过调控 DNA 修复机制（如优化同源臂长度、抑制非同源末端连接），尝试在毕赤酵母单个基因组位点一次性整合 11 个 DNA 片段（总长度超 26 kb）—— 这些片段涵盖番茄红素合成的完整路径，成功实现 “一步构建完整代谢路径”，为复杂天然产物的合成提供了高效手段。
3. 双 gRNA 介导 27 kb 大片段敲除：优化基因组背景
工业菌株的改造常需敲除冗余代谢路径（如与目标产物竞争底物的途径），研究通过 “同时设计并导入两个 gRNA”，在毕赤酵母基因组中靶定 27 kb 大片段的两端，同时引入双链断裂（DSB），借助同源定向修复实现该大片段的精准敲除 —— 这一技术可快速清除冗余代谢流，为目标产物合成 “腾出碳源与能量”，提升产物得率。
4. 首次构建多基因组合文库：平衡代谢流，挖掘高产潜力
多基因路径中，基因表达强度的失衡会导致中间产物积累或底物浪费。研究首次在毕赤酵母中设计 “多基因路径组合文库”：以番茄红素合成路径的 11 个基因为对象，为每个基因搭配不同强度的启动子（强、中、弱），构建包含多种表达强度组合的文库；通过高通量筛选（利用番茄红素的红色荧光特性），快速找到最优表达组合，验证 “组合文库平衡代谢流” 的可行性 —— 这为其他复杂代谢路径（如黄酮、生物碱合成）的优化提供了可复用的思路。
五、总结：毕赤酵母细胞工厂的 “未来可期”
本研究围绕毕赤酵母基因编辑的核心痛点，通过优化 CRISPR 工具、突破大片段整合与敲除限制、构建组合文库，为其向 “高效多基因调控型细胞工厂” 转型奠定了基础。这些技术不仅可用于番茄红素等萜类产物的合成，还可拓展至抗体药物、工业酶、其他高价值天然产物的生产，推动毕赤酵母在工业生物技术领域的应用升级。
随着这些技术的进一步完善，毕赤酵母有望凭借其 “GRAS 属性 + 高效翻译后修饰 + 无 Crabtree 效应” 的独特优势，成为与酿酒酵母并驾齐驱的微生物细胞工厂 “明星宿主”，为绿色生物制造的规模化发展提供更强支撑。
泰克生物聚焦毕赤酵母细胞工厂的技术升级，提供 CRISPR 编辑专用 gRNA 载体（含 GFP 筛选标记）、多基因表达盒构建试剂盒及代谢路径组合文库筛选辅助工具，助力科研人员高效突破多基因改造瓶颈，加速毕赤酵母细胞工厂的产业化落地。
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