一、为何双抗夹心ELISA必须使用配对抗体？
双抗夹心酶联免疫吸附测定（Sandwich ELISA）是检测和定量复杂样本中特定抗原（尤其是蛋白质）最常用且最可靠的方法之一。其高特异性和灵敏度的核心在于使用一对能够同时、且非竞争性地结合同一抗原分子上不同表位（抗原决定簇）的单克隆抗体。这对抗体分别被称为捕获抗体和检测抗体。捕获抗体预先固定于固相载体上，负责从样本中特异性"捕获"目标抗原；检测抗体（通常与报告酶如HRP偶联）则与已被捕获的抗原结合，形成"抗体-抗原-抗体"的三明治复合物，最终通过酶催化底物反应产生可检测信号。因此，成功建立夹心ELISA的先决条件，便是获得一对高效、特异的配对抗体。
二、配对抗体制备的理论基础与挑战是什么？
一个蛋白质抗原通常拥有多个不同的抗原表位。当用该抗原免疫动物后，其免疫系统会产生针对不同表位的多种抗体。从原理上讲，选择两个分别针对不同表位的抗体，便有可能使其同时结合于同一个抗原分子上，构成配对抗体。
然而，理论上的"不同表位"并不等同于实践中的"可同时结合"。在抗体筛选过程中主要面临两大挑战：
1.空间位阻效应：即使两个表位在空间上不重叠，如果它们距离过近，一个较大抗体分子（IgG，约150 kDa）的结合可能通过其空间结构，物理性地阻碍第二个抗体的接近与结合。
2.构象影响效应：第一个抗体与抗原的结合可能引起抗原局部或整体构象的改变，导致第二个抗体所识别的表位被遮蔽或结构发生变化，从而无法有效结合。
因此，获得大量针对不同表位的单克隆抗体仅仅是第一步，后续必须通过系统的功能性筛选，才能鉴定出真正能够协同工作的高性能配对抗体。
三、如何系统性地制备候选单克隆抗体库？
配对抗体的筛选建立在拥有一个多样性丰富的单克隆抗体库基础上。通常采用杂交瘤技术进行制备，关键步骤包括：
1.抗原制备与免疫：使用高纯度、正确折叠的重组蛋白或天然蛋白作为免疫原。为获得针对不同表位的抗体，通常需要免疫多只动物（如小鼠），并可能采用不同的免疫策略（如不同佐剂、免疫位点）以最大化抗体的表位多样性。
2.杂交瘤融合与筛选：取免疫动物脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。随后通过初级筛选（通常用抗原包被的ELISA）从成千上万个杂交瘤克隆中初步筛选出能分泌特异性抗体的阳性孔。
3.单克隆化与扩大培养：对阳性孔进行有限稀释等单克隆化操作，确保每个最终扩增的细胞系来源于单个B细胞，从而分泌单一、均质的单克隆抗体。对获得的单克隆杂交瘤进行扩大培养，收集上清或制备腹水，纯化得到大量单克隆抗体。
一个庞大的、表位覆盖广泛的单克隆抗体库是成功筛选出优质配对抗体的物质保障。
四、如何通过功能性筛选鉴定出高性能配对抗体？
获得单克隆抗体库后，下一步是进行系统的配对筛选，以鉴定出最佳的捕获与检测抗体组合。经典的方法是使用微孔板进行矩阵式双抗夹心ELISA筛选：
1.实验设计：将所有待筛选的单克隆抗体进行编号。在一个微孔板中，将每一种抗体分别作为捕获抗体包被在不同的孔中。
2.夹心检测流程：
-抗原结合：向所有孔中加入固定浓度的纯化目标抗原，孵育后洗涤。
-检测抗体结合：将每一种单克隆抗体分别与报告酶（如HRP）进行偶联，制备成检测抗体。然后，将每一种酶标检测抗体依次加入到包被了不同捕获抗体的孔中（即进行"捕获抗体×检测抗体"的矩阵组合），孵育后洗涤。
-信号读取：加入酶底物显色，测量各孔的吸光度值。
3.结果分析与配对鉴定：
-阳性信号：如果某个"捕获抗体A + 检测抗体B"的组合产生了强阳性信号，而单独捕获抗体A或检测抗体B的背景信号很低，则表明抗体A和B能够同时、非竞争性地结合抗原，是一对候选配对抗体。
-验证与优化：对初步筛选出的阳性组合进行反向验证（即交换角色，将B作为捕获抗体，A作为检测抗体），并测试不同抗原浓度下的剂量反应，以确认其配对的有效性和检测灵敏度。最终选择信号强度高、背景低、线性范围好的组合作为最终配对抗体。
五、配对抗体筛选中有哪些关键考量因素？
成功的筛选不仅依赖于流程，更在于细节的把握：
1.抗体表位多样性分析：在筛选前或筛选中，可利用竞争ELISA、表位分组（Epitope Binning）技术（如表面等离子共振SPR、生物膜干涉技术BLI）对抗体库进行初步分组，识别结合相同或不同表位的抗体群体，这可以大大减少盲目配对的工作量，优先测试不同表位组的抗体。
2.检测抗体的标记：酶标记过程（如HRP偶联）必须优化，以确保标记效率高且不损害抗体的结合活性和特异性。标记后的抗体需进行滴度测试。
3.排除"钩状效应"干扰：在筛选和后续应用开发中，需测试高浓度抗原下是否会出现因抗原饱和导致的信号平台期或下降（钩状效应），以确保配对抗体适用于预期的样本浓度范围。
4.应用场景验证：最终筛选出的配对抗体必须在真实的样本基质（如血清、血浆、细胞培养上清）中进行测试，评估其抗基质干扰能力、检测下限和实际工作浓度。
