Texas Red-LNT，Texas Red标记乳糖-N-四糖，长波红光荧光染料的标记方法

Texas Red-LNT 是将荧光染料 Texas Red 与 乳糖-N-四糖（Lacto-N-tetraose, LNT） 共价偶联形成的功能化糖类分子。该分子结合了 Texas Red 的红光荧光性能和 LNT 的糖链生物识别能力，可用于糖-受体研究、乳糖低聚糖代谢分析、免疫学实验及荧光探针开发。

乳糖-N-四糖（LNT） 是母乳低聚糖（Human Milk Oligosaccharides, HMOs）中常见的四糖，由乳糖（Galβ1-4Glc）为还原端，连接 N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）及半乳糖形成 β1,3 和 β1,4 糖苷键排列。其多羟基结构保证糖链生物识别能力和水溶性。

Texas Red 是长波红光荧光染料，激发波长约 596 nm，发射波长约 615 nm，水溶性良好且荧光稳定，可通过 NHS 酯或异氰酸酯与糖链偶联。

Texas Red-LNT 的化学设计通过 Texas Red 活化官能团与 LNT 的还原端醛基或氨基形成稳定共价键，实现荧光标记且保持糖链功能。

Cyanine 3-LNT，Cy3-乳糖-N-四糖Cy3-LNT
Cyanine 5-LNT，Cy5-乳糖-N-四糖Cy5-LNT
Cyanine 7-LNT，Cy7-乳糖-N-四糖Cy7-LNT

二、化学结构特点

LNT 糖链

四糖链由乳糖、GlcNAc 和半乳糖线性连接；

含多个羟基官能团，可通过化学修饰选择性偶联；

β-1,3 和 β-1,4 糖苷键保持空间构象完整，保证与糖结合蛋白（lectins）或受体特异结合。

Texas Red 荧光染料

苝咔啉或羧基苯环结构提供红光荧光；

含末端活性基团（NHS 酯、异氰酸酯或羟胺衍生物），可与糖链羟基或氨基偶联；

偶联后荧光信号稳定，适合细胞成像及体内追踪。

Texas Red-LNT 共价结构

Texas Red 与 LNT 通过肟键、酰胺键或醚键连接；

糖链结构保持完整，水溶性良好；

荧光端可通过 PEG 链或直接偶联在糖末端，避免荧光猝灭。

三、合成路线

Texas Red-LNT 的合成路线主要包括 糖链准备、糖链官能化、Texas Red 活化以及偶联反应。具体步骤如下：

1. 糖链官能化与保护

LNT 含有多羟基，为避免非特异性偶联，采用保护基（如乙酰基或叔丁基二甲硅基）屏蔽非目标羟基；

保留还原端醛基或通过氨基修饰提供偶联位点；

保护后的糖链水溶性好，可溶于有机/水混合体系中。

2. Texas Red 活化

采用 Texas Red NHS 酯或异氰酸酯衍生物进行活化；

NHS 酯可与糖链氨基反应形成酰胺键，异氰酸酯可与羟基反应形成醚键或脲键；

活化步骤在避光、低温下进行，以保持荧光性能。

3. 偶联反应

将保护后的 LNT 溶解于缓冲液或有机-水混合溶液中；

向溶液中加入 Texas Red 活化衍生物，控制摩尔比和温度（室温或 4–25°C）；

偶联过程通过亲核加成或肟键形成稳定共价键：

NHS 酯偶联机制：糖链氨基攻击 NHS 酯碳原子，形成酰胺键，释放 NHS；

肟键偶联机制（还原端醛基）：糖链还原端醛基与 Texas Red 羟胺反应形成肟键，稳定且温和；

异氰酸酯偶联机制：糖链羟基对异氰酸酯碳原子进行亲核加成，生成醚键或脲键。

反应时间一般为数小时至过夜，室温或低温条件下完成，避免糖链降解和荧光猝灭。

4. 保护基去除

偶联完成后，去除糖链保护基（如酸性条件或醇解）恢复糖羟基；

保持 LNT β-1,3/1,4 糖苷结构完整，确保生物识别功能。

5. 纯化

偶联产物通过高效液相色谱（HPLC）、凝胶渗透色谱或透析去除未反应的 Texas Red、保护基残留和副产物；

分子水溶性良好，可直接溶于生理缓冲液中，便于下游应用。

四、反应特点与注意事项

偶联选择性高

通过保护基策略和活化衍生物，偶联仅发生在目标位点；

避免多点偶联导致糖识别受阻或荧光猝灭。

温和反应条件

室温或低温，pH 7–8 缓冲液体系；

避光操作保护 Texas Red 荧光稳定性。

稳定共价键形成

形成肟键、酰胺键或醚键，水溶性良好，适合生物体系使用；

糖链 β-1,3/1,4 结构保持完整。

功能整合

Texas Red 红光荧光与 LNT 糖识别功能协同；

偶联密度可调控，避免荧光猝灭或糖识别受阻。

五、主要应用

糖受体识别与成像

Texas Red-LNT 可用于研究细胞表面 lectins 或糖受体；

红光荧光适合共聚焦显微镜、流式细胞术及活细胞成像。

乳糖低聚糖代谢研究

可追踪 LNT 在体外或体内的吸收、分布和代谢；

分析母乳低聚糖在肠道微生物代谢中的作用。

免疫学研究

LNT 可识别特定糖结合蛋白或免疫受体；

Texas Red-LNT 可用于受体定位、信号传导研究及免疫反应分析。

荧光探针与多功能平台

红光荧光信号减少自发荧光干扰；

可与纳米载体或脂质体结合，实现多功能探针和靶向递送研究。

定量分析与动态追踪

荧光强度与糖结合量成正比，可进行定量分析；

可追踪 LNT 在细胞或组织内的分布和时间动态。

六、总结

Texas Red-LNT 是通过 Texas Red 活化衍生物与 LNT 偶联 构建的功能化荧光糖分子，其合成路线特点包括：

糖链保护和官能化策略高选择性偶联；

偶联温和，避光室温，保持荧光和糖链完整；

稳定共价键形成（肟键、酰胺键或醚键）；

荧光端与糖链功能协同，保持 LNT 识别能力；

可控偶联密度，避免荧光猝灭或糖识别阻碍；

纯化后水溶性好，可直接用于生物体系；

广泛应用于糖受体研究、代谢分析、免疫学实验和荧光探针开发。

Texas Red-LNT 是糖生物学研究及功能化荧光探针开发的重要工具，将荧光标记与乳糖-N-四糖功能整合，兼具高水溶性、生物相容性及成像追踪功能。