非标记定量（LFQ）

非标记定量（LFQ）是一种无需对样品进行同位素或荧光标记的定量蛋白质分析技术。通过质谱仪对样品中肽段的相对丰度进行定量分析，LFQ能够在保持样品结构原貌的同时，提供高灵敏度、高通量的蛋白质定量信息。 非标记定量（LFQ）的核心在于通过分析蛋白质在不同样品或处理条件下的相对丰度变化，揭示潜在的生物学机制。相比于传统的标记定量法，LFQ技术操作简单，成本低廉，且不受标记效率影响，能够在不改变蛋白质结构的前提下进行分析。此外，LFQ在研究复杂生物体系中的动态变化及生物标志物发现方面具有独特的优势。通过LFQ，研究人员可以快速识别和定量复杂样品中的蛋白质，从而更好地理解细胞功能、疾病机制和药物作用。

一、非标记定量（LFQ）原理

1、信号强度法

蛋白质经胰酶酶切成肽段，再经液相色谱分离，利用电喷雾离子源产生气相离子，质谱仪按质荷比分离并记录。在一级质谱图中，母离子的信号强度与离子浓度相关，提取鉴定肽段对应的离子峰强度，如峰高度、峰面积和峰容积等，可反映肽段丰度，进而反映蛋白质丰度。

2、谱图计数法

样品中蛋白质丰度越高，酶切产生的肽段越多，经质谱分析，鉴定到的唯一匹配肽段及对应的二级谱图数也越多。通过直接统计蛋白质所有肽段的二级谱图数总和来反映蛋白质丰度。

二、技术流程

1、蛋白质提取与制备

非标记定量（LFQ）分析的首要步骤是从生物样品中提取总蛋白，并通过一系列分离与纯化步骤去除杂质。这包括细胞裂解、离心、滤过等过程，以确保获得高质量的蛋白样品。

2、肽段酶解

提取的蛋白质通常通过胰蛋白酶等特异性酶切割成肽段。这一过程需在严格控制的条件下进行，以确保酶解的效率及准确性，从而影响后续的定量分析。

3、质谱分析

非标记定量的核心技术是质谱分析。通过液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS），研究人员可以对肽段进行分离和检测。质谱仪根据肽段的质荷比（m/z）进行分辨，记录每个肽段的信号强度，为后续的定量分析提供基础。

4、数据处理与分析

质谱数据的处理是LFQ分析中的关键步骤。通过专业的软件工具，研究人员可以对原始数据进行校正、归一化和差异分析，以识别样品间蛋白质相对丰度的变化。

三、常见问题

1、样品差异

非标记定量（LFQ）分析的准确性依赖于样品间的一致性。因此，在样品处理和制备过程中，需严格控制操作条件，避免引入实验误差。

2、信号噪音

质谱分析中，背景噪音和离子抑制效应可能影响定量结果的准确性。优化质谱参数及提高样品纯度是降低噪音的一种有效途径。

3、生物重复

由于生物系统的复杂性，LFQ分析需进行多次生物重复，以增加实验的可靠性和统计学意义。

非标记定量（LFQ）能够检测和定量在不同样品中低丰度的蛋白质，为生物标志物的发现提供可能。无需标记步骤，LFQ能够分析大量样品，适用于大规模蛋白质组定量研究。