一、基础性质

• 英文名称：β-Casomorphin (1-3) amide；Tyr-Pro-Phe-NH₂ Peptide；YPF-NH₂ peptide
• 中文名称：β- 酪啡肽（1-3）酰胺；3 肽超短链阿片活性片段；μ- 阿片受体弱结合探针肽
• 多肽序列：H-Tyr-Pro-Phe-NH₂
• 单字母序列：H-YPF-NH₂
• 等电点（pI）：理论值 6.8-7.3
• 分子量：约 424.50 Da
• 分子式：C23H28N4O4
• 外观与溶解性：白色粉末，纯度≥98%；易溶于水、PBS 缓冲液（pH 6.5-7.4）、稀盐酸溶液，微溶于甲醇、乙醇，不溶于氯仿、乙醚等非极性溶剂；水溶液浓度达 25 mg/mL 时无聚集、无浑浊，稳定性良好。
• 稳定性：-20℃干燥避光条件下可保存 30 个月以上；水溶液在 4℃下稳定 25 天，37℃生理条件下半衰期约 18 小时；序列中 Pro 残基的刚性吡咯烷环结构，赋予其一定抗胰蛋白酶水解能力；C 端酰胺化修饰完全阻断羧肽酶的降解位点，稳定性比未酰胺化的（1-3）片段提升约 4 倍；Tyr 残基易被氧化，长期储存需添加抗氧化剂（如 DTT）并避光密封保存。
• 结构式：

二、核心生物活性与作用机理

1. 核心生物活性

β-Casomorphin (1-3) amide 因仅保留核心结合基序且缺乏辅助结合残基，生物活性极弱，仅在高浓度下表现出轻微的外周效应，无临床应用价值，主要用于构效关系研究，具体表现为：

• 极弱胃肠道蠕动抑制作用：在高浓度（20 mg/kg）灌胃时，可轻度激活胃肠道平滑肌细胞表面的外周 MOR，减慢肠道蠕动；在小鼠轻度腹泻模型中，仅能使腹泻次数减少 10%-15%，活性约为 β- 酪啡肽（1-4）酰胺的 10%，对中重度腹泻无缓解效果。
• 微弱外周镇痛作用：在极高剂量（30 mg/kg）局部注射时，对大鼠角叉菜胶炎性痛有轻微缓解作用，痛阈提升约 10%，且作用持续时间不足 2 小时，远弱于（1-4）酰胺片段的镇痛活性。
• 无免疫调节与肠道微生态调节活性：因活性强度不足，无法激活免疫细胞表面的 MOR，也不能影响肠道菌群结构，在相关动物模型中无明显效应。

2. 作用机理

该肽段的微弱生物活性基于与外周 MOR 的低亲和力结合及下游 Gi/o 蛋白信号通路的极弱激活，核心机制与家族长链片段一致，但信号传导效率极低，具体如下：

1. 受体识别与结合
   N 端 YPF 基序的 Tyr 酚羟基与 MOR 跨膜区的 Asp¹⁴⁶残基形成单一氢键，Phe 的苯环嵌入受体的疏水结合口袋，Pro 残基的刚性结构维持基序构象稳定；C 端酰胺化修饰通过增强疏水相互作用，辅助肽段与受体结合，但因缺乏 C 端延伸残基的额外氢键支撑，肽段与受体的结合极不稳定，解离速率极快（解离速率常数 Koff≈0.1 min⁻¹），仅能触发受体的短暂、微弱构象变化。
2. 下游信号通路激活
   短暂激活的 MOR 偶联 Gi/o 蛋白，极轻度抑制腺苷酸环化酶（AC）活性，使细胞内 cAMP 水平轻微下降；微弱激活内向整流钾通道（Kir3），促进少量 K⁺外流，导致胃肠道平滑肌细胞或感觉神经末梢细胞膜轻度超极化，因信号强度不足，仅能产生极微弱的生理效应。

三、应用领域与原理

1. 主要应用领域

• β- 酪啡肽家族构效关系研究：作为家族最短活性片段，用于解析核心结合基序的功能边界与C 端残基延伸的增效机制；通过与（1-4）酰胺、（1-5）酰胺等片段的对比，明确每一个 C 端延伸残基对受体结合亲和力、生物活性的贡献权重，是肽段结构生物学研究的关键工具分子。
• μ- 阿片受体结合特异性研究：作为 MOR 的弱选择性探针分子，用于体外受体竞争结合实验，区分特异性结合与非特异性结合，提升实验数据的准确性；同时可用于解析 MOR 结合口袋对短链肽的识别规律。
• 食品蛋白酶解产物定性分析：作为牛乳酪蛋白酶解的特征性短肽，可通过高效液相色谱 - 质谱联用（HPLC-MS）检测其含量，判断酶解反应的进行程度，辅助优化功能性肽段的制备工艺。

2. 应用原理

• 构效关系研究原理：通过体外受体结合实验，对比该肽段与 β- 酪啡肽（1-4）酰胺、（1-5）酰胺的 MOR 结合常数（Kd），明确 C 端每添加 1 个残基可使结合亲和力提升约 10 倍；通过定点突变 Phe 残基为 Ala，验证芳香族氨基酸对受体结合的必要性。
• 受体结合特异性研究原理：在稳定表达人源 MOR、DOR、KOR 的细胞系中，以该肽段为低亲和力配体，进行竞争结合实验，排除非特异性结合信号，精准计算高亲和力配体（如吗啡肽）的结合参数。

四、研究进展

1. 活性增强修饰研究：通过在该肽段的 N 端引入苯丙氨酸侧链修饰，增强其与 MOR 疏水口袋的结合能力，修饰后的肽段对 MOR 的结合亲和力提升约 3 倍，胃肠道蠕动抑制活性恢复至（1-4）酰胺片段的 25%。
2. 构象稳定化研究：利用环化修饰技术将该肽段构建为环肽，通过限制构象灵活性提升与受体的结合稳定性，环化后的肽段解离速率降低 50%，生物活性显著增强，为短链阿片肽的结构优化提供了新思路。
3. 酶解产物检测技术优化：建立基于该肽段的 ELISA 检测方法，可快速定量牛乳酪蛋白酶解产物中的 β- 酪啡肽活性片段，检测灵敏度提升至纳摩尔级别，适用于工业化生产中的质量控制。

五、相关案例分析

1. 酰胺化修饰必要性案例：将该肽段与未酰胺化的（1-3）片段（YPF-OH）进行受体结合实验，YPF-NH₂对 MOR 的结合率为 15%，而 YPF-OH 的结合率不足 1%，证实酰胺化修饰是维持其弱活性的必需条件。
2. 残基延伸增效案例：在小鼠腹泻模型中，灌胃给予 20 mg/kg 的该肽段，腹泻次数减少 12%；相同剂量的（1-4）酰胺片段减少腹泻次数 55%，（1-5）酰胺片段减少 40%，直观体现 C 端残基延伸对活性的增效作用。
3. 稳定性对比案例：该肽段在 37℃人工肠液中的半衰期为 18 小时，未酰胺化的（1-3）片段半衰期仅为 3 小时；添加羧肽酶后，未酰胺化片段在 1 小时内完全降解，而该肽段仍保留 70% 的结构完整性，证实酰胺化修饰的稳效作用。