做NGS（下一代测序/高通量测序）实验时，我们总盼着测序仪“吐”出的原始数据能直接用——毕竟从样本制备到上机测序，每一步都耗费了时间和经费。但现实是，刚拿到的原始数据里藏着不少“杂质”，直接用来分析只会让结果跑偏。

今天就跟大家聊透NGS数据分析的“第一关”——数据过滤。搞懂这一步，才能让后续的比对、变异检测、差异分析更靠谱～

一 先搞懂：为什么必须做数据过滤？

测序过程会产生多种类型的低质量或干扰性数据，主要包括：

• 测序仪本身的技术限制：碱基识别时出现错判（比如把A当成T）；

• 实验过程中的污染：样本交叉污染、接头序列残留（建库时连接的接头没去除干净）；

• 低质量序列：测序末端的信号衰减，导致碱基质量值极低，可信度差；

• 冗余序列：大量重复的reads，会增加后续分析的计算量，还可能干扰定量结果。

如果不先清理，这些问题会放大到下游的每一步：比对率下降、假阳性上升、变异检测灵敏度受损等。因此，拿到 FASTQ 后的第一步，就是做“干净、可用”的数据过滤。

二 重点看：过滤掉的都是哪些“坏数据”？

数据过滤不是“一刀切”，而是有针对性地剔除几类特定的“问题序列”，常见的过滤目标主要有4种：

1. 低质量碱基与低质量reads

每个测序碱基都会有一个质量值用Qhred值表示（简称Q值），其与测序错误率 E的换算关系为：

Qphred = −10 log10 E

Q值越高，说明这个碱基的识别越准确：

• Q20：碱基正确的概率≥99%，错误率≤1%；

• Q30：碱基正确的概率≥99.9%，错误率≤0.1%（常用的“高质量标准”）。

过滤时，会先扫描每个reads的碱基质量分布：如果reads末端的Q值持续低于阈值（比如Q20），就会截断这部分低质量序列（叫“截尾”）；如果截尾后reads的长度太短（比如短于36bp），就直接剔除这个reads；另外，整个reads的平均质量值低于阈值的，也会被过滤掉。

2. 接头污染序列

建库时，为了让DNA片段能结合到测序芯片上，会给片段两端连接特定的“接头序列”。理想情况下，测序只针对目标片段，但实际中难免会测到接头序列——这些接头序列不属于样本本身，必须剔除。

如果不剔除接头，后续比对时，这些“外来序列”可能会错误地比对到基因组上，导致假阳性结果。现在的过滤工具（比如Trimmomatic）能精准识别接头序列，并将其从reads中切除。

3. N含量过高的reads

“N”代表测序仪无法识别的碱基——如果一个reads里N的比例过高（比如超过5%），说明这个reads的可信度极低，后续分析无法利用，直接过滤即可。

4. 冗余重复reads

测序过程中会产生大量完全相同或高度相似的重复reads（比如PCR扩增时的偏好性导致某些序列被过度扩增）。这些重复reads不仅会增加服务器的计算负担，还可能导致基因表达定量偏高、变异检测假阳性升高。

过滤时，会通过去重工具（比如Picard MarkDuplicates）识别并标记这些重复reads，后续分析时忽略它们的影响。

三 实操篇：常用的过滤工具

搞懂了过滤目标，接下来就是“怎么操作”。生信领域有很多成熟的开源工具，不用自己写代码，掌握核心参数就能用，常见的有这几个：

1. Trimmomatic（最常用的通用过滤工具）

支持单端（SE）和双端（PE）测序数据，功能全面，能同时完成接头切除、质量截尾、低质量reads过滤。

2. FastQC

严格来说，FastQC不是过滤工具，而是“过滤前的质检工具”——它能生成详细的质量报告，包括碱基质量分布、接头含量、N含量、重复序列比例等。建议在过滤前后分别运行FastQC：过滤前用于诊断数据问题，指导参数设定；过滤后用于验证过滤效果。

3. Picard MarkDuplicates

主要用于去除PCR重复和测序重复reads，尤其适合全基因组测序（WGS）、全外显子测序（WES）数据。它会通过比对后的坐标信息，识别重复reads并标记，后续分析软件会自动忽略标记的reads。

四 避坑指南：数据过滤的3个关键注意事项

数据过滤看似简单，但参数设置不当，很可能“筛掉有用的数据”或“留下有害的杂质”，这3个坑一定要避开：

1. 不要过度过滤

比如把质量阈值设得过高、最短reads长度设得太长，可能会导致有效数据量大幅减少，尤其是样本本身测序深度不高的情况，会影响后续分析的统计效力。建议根据数据质量和研究目的设置阈值。

2. 双端数据要“同步过滤”

如果是双端测序（PE，即一个DNA片段的两端都测序），过滤时要保证一对reads的完整性：如果其中一条reads被剔除，另一条也要一起剔除，否则会导致后续比对时出现“单条reads”，影响分析结果。Trimmomatic等工具会自动处理双端数据的同步问题，不用手动操作。

3. 保留过滤日志，便于追溯

记录过滤前后的reads数量、质量分布、接头切除比例等信息，便于质量评估、过程追溯与研究复现。

五 总 结

其实数据过滤的逻辑很简单：“去伪存真”——通过针对性剔除低质量、污染、冗余的序列，让数据更“干净”、更可靠。这一步虽然基础，但直接决定了后续分析的成败，千万不能省略或敷衍~