RNA-seq与qPCR是一对黄金搭档，RNA-seq凭借高通量优势实现差异基因的全景筛选，qPCR则以高特异性和高灵敏度完成候选基因的精准验证。但是有时候我们会遇到用qPCR验证RNA-seq筛选出的差异基因时，却发现两者的表达趋势并不一致，甚至完全相反。

“是RNA-seq的数据不准？还是qPCR实验操作出了问题？”“这些不一致的结果该如何解释？论文里该怎么呈现？”

事实上，转录组测序与qPCR结果不一致并非个例，研究表明，两者的相关性通常在0.8左右，存在15.1%-19.4%的结果无法匹配，其中1.6%-2.8%的结果甚至完全相反。但这并不意味着其中一项技术失效，更多是由实验设计、技术原理、操作细节等多方面因素共同导致的。

图 RT-qPCR和RNA-seq数据之间的基因表达相关性（Everaert et al., 2017）。

图 对不一致基因的量化（Everaert et al., 2017）。

一、先搞懂：为什么转录组测序和qPCR会“打架”？

01.检测范围不同

转录组测序是全景式扫描，能同时检测样本中几乎所有转录本的表达，适合大规模差异基因筛选；而qPCR是精准靶向打击，仅针对预设的特定基因进行定量，更适合验证已知候选基因。从检测范围来看，RNA-seq几乎覆盖基因的全部外显子区域，因此其计算的基因表达量是该基因所有转录本表达水平的综合体现；而qPCR需设计特定引物扩增基因的80-200bp片段，通常只能覆盖部分转录本，无法代表基因的整体表达情况。此外，转录组文库构建与测序过程中，不可避免会引入PCR扩增偏差和测序重复序列，这些因素会进一步影响定量准确性。

02.定量原理不同

RNA-seq通过测序读段（reads）的计数的定量，最终以FPKM/TPM等指标反映基因表达量，本质是相对定量；qPCR则基于PCR扩增过程中荧光信号的累积速度，通过Ct值计算相对或绝对表达量，受扩增效率影响显著。

03.灵敏度与动态范围不同

qPCR的动态范围更宽，对低丰度基因的检测灵敏度更高；而RNA-seq对低丰度基因的检测易受测序深度限制，可能出现检测不到或定量偏差的情况。

所以我们无需追求“所有基因100%一致”，重点应关注核心候选基因的趋势一致性以及整体验证基因的相关性。当出现明显不一致时，再系统排查技术或生物学层面的原因。

二、结果不一致的核心原因

（一）样本与实验设计方面

01.样本批次/来源不一致

基因表达具有时效性和环境敏感性，不同批次的样本或不同处理条件可能导致基因表达模式发生改变。即使是同一来源的样本，冻存时间过长也可能导致RNA降解，进而影响表达量检测。如果转录组测序与qPCR使用的不是同一批冻存的RNA样本，或qPCR使用了重新提取的RNA，结果不一致的概率会大幅增加。例如，RNA-seq使用的是冻存3个月的样本，而qPCR使用的是新鲜制备的样本。

02.样本污染或质量完整性不达标

（1）gDNA污染：若RNA提取后未进行DNase消化，qPCR引物若未跨外显子设计，会同时扩增gDNA和mRNA，导致Ct值偏低、表达量被高估。

（2）rRNA污染：转录组测序需去除rRNA以富集mRNA，若rRNA去除不彻底，会占用测序资源，导致目标基因的测序深度不足、表达量被低估。

（3）RNA降解：RNA极易从3'端开始降解，若样本降解严重，依赖Poly(A)尾的RNA-seq文库构建（常用Oligo(dT)引物）会因mRNA的3'端Poly(A)尾受损而无法有效捕获目标转录本，导致该基因在RNA-seq中被低估或检测不到；而qPCR若使用特异引物，可从RNA片段内部启动逆转录，仍能检测到降解样本中的目标基因，从而出现结果不一致。

03.样本异质性影响

样本为混合细胞群体（如组织样本、肿瘤样本），RNA-seq和qPCR检测的细胞亚群存在差异。复杂样本中不同细胞亚群的基因表达模式差异较大，RNA-seq检测的是整个样本的平均表达水平，而qPCR若使用的是样本中某一局部区域的RNA，就可能因细胞亚群比例不同导致结果不一致。

04.生物学重复设置不足或离群样本未剔除

转录组测序通常需要3个及以上生物学重复以减少随机误差，若重复数不足，或存在明显的离群样本却未剔除，差异基因的筛选结果可能不可靠。qPCR若使用了该离群样本，自然会出现不一致。

（二）实验技术和生信分析方面

01.引物设计偏差

qPCR引物特异性差/引物二聚体/扩增效率异常/引物设计位置不当/未跨外显子边界。

02.测序深度不足

测序深度决定了低丰度基因的检测能力。若测序深度不足，低丰度基因的测序读段可能过少，甚至无法被检测到，导致转录组结果显示无表达。

03.差异表达基因筛选参数不当

RNA-seq筛选差异基因时，P值、FDR值、差异倍数（FC）的阈值设置不合理。

（三）生物学机制方面

01.可变剪接与转录本异构体差异

许多基因通过可变剪接产生多个转录本异构体，不同异构体的表达趋势可能完全不同。转录组测序通常计算的是全基因所有异构体的总表达量，而qPCR若靶向某一特异性异构体的独特区域，检测的只是该异构体的表达量，若两者趋势相反，会出现结果不一致。

02.基因融合现象

在肿瘤等复杂样本中，基因融合是常见的分子事件。常规转录组测序可能无法准确识别低频率的融合基因，或因融合断点未知导致定量偏差；而qPCR若针对融合区域设计引物，能特异性检测融合基因的表达，导致两者结果不一致。

三、排查流程

可先根据验证基因的趋势一致情况进行初步分类判断，再进入第二步深度分析：

结语

RNA-seq与RT-qPCR本就各有独特优势，也存在固有局限。当两者结果出现分歧时，绝非意味着某一方的结果出错，反而在提醒我们：实验中或许藏着被忽略的技术细节，或样本里蕴含着未被发掘的分子生物学奥秘。每一次结果不一致都是深入理解实验原理和生物学现象的契机，理性分析、系统排查，就能让“打架”的结果成为科研突破的助力！

参考文献

Everaert C, Luypaert M, Maag J L V, et al. Benchmarking of RNA-sequencing analysis workflows using whole-transcriptome RT-qPCR expression data[J].Scientific reports,2017, 7(1): 1559.