作者，Evil Genius
现在发个好一点的文章都要求多组学了，基因组 + 单细胞 + 空间算是风口的多组学，不过随着认识的深入， 蛋白结构的研究也慢慢纳入了进来，其中最核心的扩展方向就是空间转录组发现了细胞对的共定位，那么共定位的锚点以及结合方式,甚至是研究破坏这种结合方式的突变或者化合物，需要结构生物学来研究。
还有VDJ，想好好研究需要全长测序。
AlphaFold3、Gromacs这些都是结构生物学必须要掌握的。
今天分享文献，文章的核心研究成果是在膀胱癌（BCa）中发现了一类表达IGLL5的B细胞亚群。在基因工程改造的人源化小鼠模型中，这些IGLL5⁺B细胞会破坏TLS结构的完整性并削弱免疫治疗应答。
知识积累
三级淋巴结构（TLS）通过高效呈递肿瘤抗原并快速激活效应免疫细胞，从而增强抗肿瘤免疫。许多实体肿瘤（尤其对免疫治疗无应答的癌症）缺乏可检测的TLS，这种缺失提示肿瘤微环境免疫原性低下并导致预后不良。
除T/B细胞相互作用外，TLS形成高度依赖于高内皮微静脉（HEV）的新生——这一驱动淋巴细胞聚集的关键过程尚未得到充分重视。
结果1、三级淋巴结构缺乏与癌症中免疫检查点阻断治疗无应答相关
与应答患者相比，ICB无应答的膀胱癌患者肿瘤内TLS数量明显减少。
肿瘤内TLS的形成经历逐步发育阶段，包括早期、初级和成熟阶段，其中成熟TLS具有最强的抗肿瘤免疫效应。因此，我们通过mIF对膀胱癌组织中的TLS进行了全面染色，观察到：
早期TLS（E-TLS）表现为T细胞和B细胞聚集；
初级滤泡样TLS（PFL-TLS）以滤泡树突状细胞（CD21⁺）为标志；
次级滤泡样TLS（SFL-TLS）则通过生发中心标记物（CD23⁺）识别。
结果2、免疫球蛋白入样多肽5+B细胞亚群在三级淋巴结构缺陷肿瘤中富集
B细胞是TLS中最丰富且空间分布最相关的细胞类型。
通过单细胞和空间组学分析，鉴定出一种新型B细胞亚群（IGLL5⁺ B细胞），该亚群在TLS缺乏的膀胱癌中显著富集。
IGLL5⁺ B细胞：
起源于滤泡外活化通路；
表型为 IgD⁺IgM⁺CD27⁻CD20⁺；
抗体分泌能力弱，体液免疫功能缺陷；
特异性存在于肿瘤微环境，尤其在ICB无应答患者中；
可被肿瘤细胞诱导分化。
这些结果提示：IGLL5⁺ B细胞可能通过抑制TLS形成，促进免疫治疗抵抗，是潜在的治疗靶点或生物标志物。
结果3、免疫球蛋白入样多肽5+B细胞与三级淋巴结构丰度及患者预后呈负相关
多重免疫荧光（mIF）染色显示，与处于发育阶段或成熟的TLS相比，IGLL5⁺ B细胞主要定位于结构被破坏的TLS中。
空间转录组测序（ST-seq）数据中，IGLL5⁺ B细胞的特征基因表达与TLS丰度呈显著负相关。
在接受ICB治疗的膀胱癌患者中，IGLL5⁺ B细胞浸润水平越高，临床预后越差。Cox回归分析进一步证实，IGLL5⁺ B细胞浸润是接受ICB治疗的膀胱癌患者总生存期（OS）。
综上所述，这些数据共同证实：IGLL5⁺ B细胞与TLS丰度呈负相关，并与接受ICB治疗的癌症患者治疗无应答及不良预后密切相关。
完整证据链：TLS缺失 → IGLL5⁺ B细胞富集 → 体液免疫缺陷 + ICB抵抗 → 预后不良。
结果4、免疫球蛋白入样多肽5*在基因工程和人源化小鼠中导致B细胞紊乱，从而破坏三级淋巴结构的建立
通过两种人源化小鼠模型（基因工程IGLL5-Hu小鼠和Hu-HSC免疫重建小鼠）证明：
IGLL5⁺ B细胞的存在会显著抑制或破坏肿瘤内TLS的形成/维持；
在IGLL5⁺ B细胞富集的小鼠中：
ICB联合化疗无法有效控制肿瘤；
肿瘤生长更快、转移更多、生存期更短；
外源补充TLS诱导因子rCXCL13可逆转IGLL5⁺ B细胞介导的治疗抵抗；
在人源免疫系统小鼠中，直接注射IGLL5⁺ B细胞即可破坏已形成的TLS，并导致ICB失效；
核心结论：IGLL5⁺ B细胞通过破坏TLS结构，直接导致免疫治疗抵抗，是TLS功能障碍的关键驱动因素。
结果5、免疫球蛋白λ样多肽5阳性B细胞通过锚定于高内皮微静脉损害其功能表型
空间转录组测序（ST-seq）分析发现，IGLL5+ B细胞与高内皮微静脉（HEV）存在显著共定位。
体外黏附实验证实，与IGLL5- B细胞相比，IGLL5+ B细胞能快速黏附于HEV，而阻断IGLL5可显著削弱此效应，验证了IGLL5在介导该黏附过程中的必要性。
综上：IGLL5+ B细胞通过IGLL5介导优先黏附于HEV，诱导HEV管腔发生破坏性扩张，从而损害淋巴细胞招募能力并破坏TLS稳态。
结果6、免疫球蛋白λ样多肽5作为高内皮微静脉上淋巴毒素β受体的配体
鉴于细胞间膜蛋白相互作用是细胞黏附的关键事件，研究了HEV膜上与IGLL5特异性相互作用的蛋白。
鉴于配体-受体结合具有可逆性和高亲和力的特征，进行了体外竞争实验，结果显示GST标记的LTβR与IGLL5特异性结合，且该结合可被未标记的LTβR竞争性抑制。重要的是，生物层干涉技术和等温滴定量热实验证实了IGLL5与LTβR之间存在稳定的高亲和力结合，表明HEV上表达的LTβR是IGLL5的受体。
为解析IGLL5-LTβR相互作用结构，使用AlphaFold3对人源LTβR和IGLL5的氨基酸序列进行预测，聚焦于相互作用界面，确定了LTβR（Y88-Q99）与IGLL5（V148-K158）之间的关键氨基酸相互作用。分子动力学模拟分析证实该复合物构象高度稳定，且对结合自由能贡献最大的残基位于上述区域。有趣的是，IGLL5会发生动态构象旋转，以“钥匙-锁”的典型配体-受体模式精确互补结合LTβR的配体结合口袋。值得注意的是，突变LTβR（Y88-Q99）或IGLL5（V148-K158）任一区域均会显著降低两者的结合亲和力。
scRNA-seq和免疫荧光数据显示，LTβR不仅表达于HEV，也表达于髓系细胞和成纤维细胞，但IGLL5+ B细胞在成熟TLS内仅特异性与HEV表达的LTβR相互作用，提示存在额外机制引导其靶向HEV。基于ST-seq的细胞通讯分析显示，IGLL5+ B细胞与成熟TLS间存在高度富集的趋化因子配体-受体互作。qRT-PCR分析发现，在富集度最高的10个趋化因子受体基因中，CCRL2和CXCR6在IGLL5+ B细胞中显著过表达，进一步验证确认CCRL2在IGLL5+ B细胞中表达显著高于IGLL5- B细胞。已有研究报道CCRL2是趋化因子CCL19的受体，后者在成熟TLS中招募免疫细胞起重要作用。我们证实，与髓系细胞或成纤维细胞相比，LTβR+ HEV具有更强的CCL19分泌能力。重要的是，体内阻断CCRL2趋化因子受体可消除IGLL5+ B细胞靶向HEV并破坏TLS完整性的能力，表明IGLL5+ B细胞通过CCL19-CCRL2趋化因子配体-受体相互作用特异性靶向HEV。
此外，跨物种序列比对、体外蛋白互作实验及体内LTβR突变敲入模型证实，IGLL5与小鼠LTβR的亲和力及互作模式与人源LTβR一致
结果7、免疫球蛋白λ样多肽5与淋巴毒素β受体互作抑制高内皮微静脉的非经典NF-κB信号传导
在免疫检查点抑制剂无应答的膀胱癌中，IGLL5+ B细胞 通过其表面蛋白 IGLL5，作为抑制性配体 与高内皮微静脉表面的淋巴毒素β受体 特异性结合。这一结合通过引发独特的受体构象变化，主动关闭了HEV赖以维持功能的关键非经典NF-κB信号通路（NIK/p100/p52），最终导致HEV结构破坏、功能丧失，并抑制了TLS的形成和抗肿瘤免疫。
详细机制分解
1. 发现与验证抑制作用
转录组学证据：对rIGLL5处理的HEV测序显示，NF-κB信号通路是显著受影响的通路。
蛋白水平验证：与IGLL5+ B细胞共培养后，HEV中NIK蛋白水平显著下降，表明非经典NF-κB信号被抑制。
配体竞争：体外实验中，rIGLL5不仅能单独抑制LTβR信号，还能拮抗LTβR的天然激活配体LTα1β2的功能，证明其扮演的是抑制性角色。
临床关联：在无应答患者肿瘤中，IGLL5的表达显著高于LTα1β2，提示这种抑制性配体-受体轴在治疗失败中占主导地位。
2. 结构生物学阐明抑制原理（“钥匙-锁”的反向扭转）
这是机制中最精妙的部分，解释了“为何结合会抑制而非激活”。
结合域定位：与激活配体LTα1β2类似，IGLL5也结合在LTβR胞外域的CRD2区域，但具体的氨基酸结合位点不同。
关键构象变化：通过结构模拟发现，激活配体LTα1β2结合后，使LTβR的胞外域与跨膜域夹角约为120°，这个构象有利于传递激活信号。
而 IGLL5结合后，强行将这个夹角扭转至180°，形成了一个与激活状态完全相反的受体构象。这种“反向扭转”是信号抑制的结构基础。
功能验证：突变IGLL5的结合位点会消除其抑制效应，而突变LTα1β2的结合位点不影响IGLL5的抑制功能，证明抑制效应完全依赖于IGLL5引发的特定构象。
3. 下游信号传导的关闭（从膜到核的级联关闭）
异常的受体构象变化触发了胞内信号复合物的解体。
关键蛋白解离：在正常（或LTα1β2激活）状态下，泛素连接酶TRAF3 与膜上的LTβR结合，通过靶向降解NIK来精细调控非经典NF-κB信号。
当IGLL5结合导致LTβR构象改变后，TRAF3从LTβR上解离并进入细胞质（通过超分辨率显微镜清晰观察到）。
信号通路崩溃：TRAF3的异常解离导致其无法正常调控NIK，NIK被过度降解。作为非经典NF-κB通路的核心激酶，NIK的缺失导致其下游p100无法被磷酸化并加工成具有转录活性的p52。整个NIK/p100/p52信号轴被彻底关闭。
4. 最终表型与功能后果（从信号到功能的丧失）
非经典NF-κB信号是HEV的“功能总开关”，其关闭引发一系列灾难性后果。
基因表达失调：该信号通路调控着大量与淋巴细胞粘附、迁移和归巢相关的分子（如黏附分子、趋化因子）。信号关闭导致这些功能基因表达全面下调。
结构破坏：HEV失去维持其特化立方体形态和凹槽状管腔的能力，转变为薄壁、管腔扩张的畸形状态。
功能丧失：畸形的HEV无法有效吸附、支撑和招募淋巴细胞（T细胞、B细胞）穿越血管壁。
TLS稳态破坏：由于淋巴细胞无法被有效募集和归巢，新的TLS无法形成，已有的TLS也会瓦解，导致肿瘤内抗肿瘤免疫应答的“根据地”丧失。
5. 体内外功能挽救实验（反向验证机制的因果关系）
通路再激活可逆转表型：使用不依赖于LTβR的非经典NF-κB通路激动剂（如CD40L）处理，可以绕过IGLL5的抑制，重新激活HEV的信号通路，从而挽救HEV的形态、功能，并促进TLS形成和肿瘤抑制。
受体敲除验证特异性：在HEV上特异性敲除LTβR后，即使存在IGLL5+ B细胞或对其进行阻断，TLS的形成都不受影响，直接证明IGLL5的破坏作用必须通过HEV上的LTβR才能实现。
整体机制流程图
IGLL5+ B细胞
↓ （通过CCL19-CCRL2趋化作用靶向归巢至HEV）
↓ （通过IGLL5与LTβR高亲和力结合）
IGLL5-LTβR结合引发LTβR构象“反向扭转”（180°夹角）
↓
膜上信号复合物解体 → TRAF3从LTβR解离入胞质
↓
NIK蛋白被异常降解，非经典NF-κB信号轴关闭（NIK↓/p100磷酸化↓/p52↓）
↓
HEV功能基因（黏附分子、趋化因子等）表达下调
↓
HEV结构破坏（管腔扩张、形态异常）→ 淋巴细胞招募能力丧失
↓
三级淋巴结构无法形成/瓦解 → 抗肿瘤免疫应答受损 → 免疫治疗（ICB）无应答 ↓ （通过CCL19-CCRL2趋化作用靶向归巢至HEV）
↓ （通过IGLL5与LTβR高亲和力结合）
IGLL5-LTβR结合引发LTβR构象“反向扭转”（180°夹角）
↓
膜上信号复合物解体 → TRAF3从LTβR解离入胞质
↓
NIK蛋白被异常降解，非经典NF-κB信号轴关闭（NIK↓/p100磷酸化↓/p52↓）
↓
HEV功能基因（黏附分子、趋化因子等）表达下调
↓
HEV结构破坏（管腔扩张、形态异常）→ 淋巴细胞招募能力丧失
↓
三级淋巴结构无法形成/瓦解 → 抗肿瘤免疫应答受损 → 免疫治疗（ICB）无应答
