一、基础性质

• 英文名称：3Flag Tag；Triple Flag Tag；MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKL peptide
• 中文名称：三重复 Flag 标签肽；3Flag 融合标签；人工设计 22 肽检测纯化标签
• 多肽序列：H-Met-Asp-Tyr-Lys-Asp-His-Asp-Gly-Asp-Tyr-Lys-Asp-His-Asp-Ile-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Leu-OH
• 单字母序列：H-MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKL-OH
• 等电点（pI）：理论值 4.0-4.5
• 分子量：约 2975.06 Da
• 分子式：C126H180N32O50S
• 外观与溶解性：白色粉末，纯度≥98%；易溶于水、PBS 缓冲液（pH 7.0-7.4）、Tris-HCl 缓冲液，微溶于甲醇、乙醇，不溶于氯仿、乙醚等非极性溶剂；水溶液浓度达 10 mg/mL 时无聚集、无浑浊，稳定性优异。
• 稳定性：-20℃干燥避光条件下可保存 24 个月以上；水溶液在 4℃下稳定 30 天，37℃生理条件下半衰期约 72 小时；序列中无易氧化的氨基酸（如 Trp、Met），抗蛋白酶水解能力较强，在细胞内和体外实验中均能保持结构稳定，不影响自身的抗原性。
• 结构式：

二、核心生物活性与作用机理

1. 核心生物活性

3Flag 作为融合标签肽，本身不具备生物学功能，但其核心活性在于与抗 Flag 抗体的特异性结合，从而实现对目标蛋白的多种研究应用，具体活性表现为：

• 高效蛋白检测：与目标蛋白融合表达后，可通过 Western blot、免疫荧光、免疫组化等技术，利用抗 Flag 抗体快速检测目标蛋白的表达水平、细胞定位及组织分布。
• 精准蛋白定量：结合酶联免疫吸附试验（ELISA）或流式细胞术，可对融合蛋白进行定量分析，具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优点。
• 高效蛋白纯化：利用偶联抗 Flag 抗体的亲和层析树脂，可对细胞裂解液中的 3Flag 融合蛋白进行一步法亲和纯化，纯化效率高（纯度可达 95% 以上），收率高，且洗脱条件温和（可使用游离的 Flag 肽段或酸性缓冲液洗脱），不影响目标蛋白的活性。
• 免疫沉淀与相互作用研究：通过免疫沉淀（IP）或免疫共沉淀（Co-IP）技术，可利用 3Flag 标签捕获目标蛋白及其相互作用的蛋白复合物，用于研究蛋白质之间的相互作用。

2. 作用机理

3Flag 标签的核心作用机理基于与抗 Flag 抗体的特异性抗原 - 抗体结合反应，具体机制如下：

1. 抗原 - 抗体特异性识别

• 3Flag 标签的每个 Flag 基序中都含有一个保守的抗原核心区（DYK），其中 Tyr 残基的芳香环通过疏水相互作用与抗 Flag 抗体的抗原结合口袋结合，Lys 残基的正电荷与抗体的负电荷氨基酸形成静电相互作用，Asp 残基的负电荷则参与电荷平衡，稳定抗原 - 抗体复合物的构象。
• 3 个 Flag 基序的串联重复设计，可与抗 Flag 抗体的多个抗原结合位点结合，形成多价结合，显著增强结合亲和力，提高检测和纯化的灵敏度。

2.融合蛋白的检测与纯化机制

• 检测机制：3Flag 融合蛋白表达后，抗 Flag 抗体可特异性识别并结合融合蛋白上的 3Flag 标签，通过酶标（如 HRP）、荧光标记（如 FITC、Cy3）或金标等方式，实现对融合蛋白的可视化检测或定量分析。
• 纯化机制：偶联抗 Flag 抗体的亲和层析树脂可特异性捕获细胞裂解液中的 3Flag 融合蛋白，未结合的杂蛋白则被洗脱液冲走；随后，通过加入游离的 Flag 肽段（竞争性结合抗体）或酸性缓冲液（改变抗体构象），可将融合蛋白从树脂上洗脱下来，实现高效纯化。

三、应用领域与原理

1. 主要应用领域

• 重组蛋白表达与检测：用于构建 3Flag 融合蛋白表达载体，在原核细胞（如 E. coli）或真核细胞（如 HEK293、CHO）中表达目标蛋白，并通过 Western blot、免疫荧光等技术检测蛋白表达。
• 蛋白亚细胞定位研究：通过构建 3Flag 融合蛋白表达载体，转染细胞后利用免疫荧光技术，结合抗 Flag 抗体和荧光显微镜，观察目标蛋白的亚细胞定位（如细胞核、细胞质、细胞膜、线粒体等）。
• 蛋白相互作用研究：利用 3Flag 标签构建诱饵蛋白表达载体，通过免疫共沉淀（Co-IP）或拉下实验（Pull-down），捕获与诱饵蛋白相互作用的靶蛋白，用于研究蛋白质之间的相互作用网络。
• 重组蛋白的亲和纯化：利用偶联抗 Flag 抗体的亲和层析树脂，对 3Flag 融合蛋白进行高效纯化，获得高纯度的重组蛋白，用于结构生物学研究、功能学研究或药物开发。

2. 应用原理

• 重组蛋白表达与检测原理：将 3Flag 标签的编码序列与目标蛋白的编码序列融合，构建到表达载体中，转染或转化宿主细胞后，利用宿主细胞的表达系统表达 3Flag 融合蛋白；通过 Western blot 技术，用抗 Flag 抗体检测细胞裂解液中的融合蛋白，判断目标蛋白的表达水平。
• 蛋白亚细胞定位原理：构建 3Flag 融合蛋白表达载体，转染细胞后培养一定时间，使融合蛋白在细胞内表达；然后对细胞进行固定、通透化处理，加入抗 Flag 抗体进行免疫染色，最后通过荧光显微镜观察荧光信号的分布，确定目标蛋白的亚细胞定位。
• 蛋白相互作用研究原理：将 3Flag 融合的诱饵蛋白表达载体转染细胞，使诱饵蛋白在细胞内表达；然后裂解细胞，用抗 Flag 抗体进行免疫沉淀，捕获诱饵蛋白及其相互作用的蛋白复合物；通过 SDS-PAGE 分离后，利用质谱技术鉴定相互作用的蛋白。
• 重组蛋白纯化原理：将 3Flag 融合蛋白表达载体转化原核细胞或转染真核细胞，大量表达融合蛋白后裂解细胞；将细胞裂解液上样到偶联抗 Flag 抗体的亲和层析柱，融合蛋白与抗体特异性结合；用洗涤缓冲液洗去杂蛋白后，用洗脱缓冲液将融合蛋白洗脱下来，获得高纯度的重组蛋白。

四、研究进展

1. 标签优化与改造：为了进一步提高 3Flag 标签的检测灵敏度和纯化效率，研究人员对其进行了改造，如在 C 端添加核定位信号（NLS）或核输出信号（NES），实现融合蛋白的定向运输；或添加蛋白酶切割位点（如凝血酶、肠激酶切割位点），便于在纯化后去除 3Flag 标签，获得天然的目标蛋白。
2. 双标签系统开发：将 3Flag 标签与其他标签（如 His 标签、GFP 标签）融合，构建双标签系统，可实现对融合蛋白的双重检测和纯化，提高检测的准确性和纯化的效率。例如，3Flag-His 双标签可同时用于免疫荧光检测和金属螯合亲和层析纯化。
3. 体内成像应用拓展：利用荧光标记的抗 Flag 抗体，结合活体成像技术，可在活体内实时监测 3Flag 融合蛋白的表达和分布，为在体研究蛋白质的功能和动态变化提供了新的工具。
4. 高通量蛋白组学应用：3Flag 标签已被广泛应用于高通量蛋白组学研究中，通过构建大规模的 3Flag 融合蛋白文库，结合免疫沉淀和质谱技术，可系统地研究蛋白质之间的相互作用网络，为生命科学研究提供了丰富的资源。

五、相关案例分析

1. 重组蛋白纯化案例：将 3Flag 标签与绿色荧光蛋白（GFP）的编码序列融合，构建到原核表达载体 pET-28a 中，转化 E. coli BL21（DE3）菌株，经 IPTG 诱导表达后，裂解细胞；将细胞裂解液上样到抗 Flag M2 亲和层析柱，用 PBS 缓冲液洗涤杂蛋白后，用含 100 μg/mL 游离 Flag 肽段的 PBS 缓冲液洗脱，获得的 GFP-3Flag 融合蛋白纯度达 98% 以上，可用于后续的功能学研究。
2. 蛋白亚细胞定位案例：构建 3Flag 融合的肿瘤抑制蛋白 p53 表达载体，转染 HEK293 细胞后，培养 24 小时；对细胞进行固定、通透化处理，加入抗 Flag M2 抗体和 Cy3 标记的二抗进行免疫染色，通过荧光显微镜观察发现，p53-3Flag 融合蛋白主要定位于细胞核中，与预期的亚细胞定位一致。
3. 蛋白相互作用研究案例：将 3Flag 标签与细胞周期蛋白 Cyclin D1 的编码序列融合，构建诱饵蛋白表达载体，转染 HeLa 细胞后，培养 48 小时；裂解细胞，用抗 Flag M2 抗体进行免疫沉淀，捕获 Cyclin D1-3Flag 融合蛋白及其相互作用的蛋白复合物；通过 SDS-PAGE 分离和质谱鉴定，发现 Cyclin D1 可与 CDK4、p21 等蛋白相互作用，进一步验证了 Cyclin D1 在细胞周期调控中的功能。